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目的:通过腺病毒介导,上调Tbx18在小鼠心脏干细胞（Cardiac stem cells,CSCs）的表达,探讨其是否可诱导小鼠CSCs向起搏样细胞分化。方法:1、小鼠CSCs的培养、分离:取SPF级昆明小鼠心脏组织,通过心肌组织块贴壁培养法培养原代小鼠CSCs;待CSCs生长至约80%融合度后,利用差速消化法分离并收集;重新铺板后行C-kit+免疫荧光鉴定。2、实验分组:将原代CSCs分为三组:（1）空白对照组:原代CSCs培养;（2）阴性对照组:以不含Tbx18基因的空病毒感染CSCs;（3）Tbx18实验组:Tbx18过表达腺病毒感染CSCs。3、Tbx18过表达载体的构建:以Tbx18质粒DNA为模板进行PCR扩增,重组到质粒载体后行基因测序,并与目的基因序列对比验证;4、Tbx18过表达腺病毒的包装和滴度测定:用构建好的Tbx18过表达载体,转染HEK293T细胞进行包装,Western-blot检测包装结果,收集病毒并扩增,检测病毒滴度;5、Tbx18感染CSCs可行性验证:观察感染Tbx18腺病毒后CSCs的生长情况及形态学变化,Western-blot检测Tbx18在小鼠CSCs中的表达;6、上调Tbx18诱导CSCs定向分化为起搏样细胞的验证:Tbx18过表达腺病毒感染CSCs后继续培养第6天,qPCR和Western-blot分别检测小鼠CSCs中HCN4在mRNA水平和蛋白水平的表达。结果:1、心脏组织块贴壁培养法获取原代小鼠CSCs:铺皿4小时后心脏组织块开始贴壁,1～2天贴壁牢固,组织块周围开始有成纤维细胞长出;5～7天,心肌组织块周围长出小、圆、亮的CSCs,其生长于成纤维细胞上层,高倍镜下不能观察到核仁;13～15天,CSCs生长至融合度约80%后消化分离并收集;C-kit+免疫荧光鉴定,荧光显微镜下随机挑选5个视野,计算GFP阳性细胞占所在视野内细胞总数的百分比,取平均值为75%。2、成功完成Tbx18载体的构建,基因测序与预期序列完全一致;Tbx18感染HEK293T细胞后第2天观察到绿色荧光表达,10～12天荧光强度达最高,收集病毒液;测定病毒滴度为1.0×1010IFU/ml;Western-Blot检测HEK293T细胞中Tbx18蛋白高表达。3、Tbx18重组腺病毒感染CSCs后,细胞在继续培养过程中,大部分细胞发生不典型的形态变化,呈梭形及不规则形,较空白对照组和阴性对照组无明显差异;Tbx18重组腺病毒感染CSCs后24小时可见绿色荧光表达,72小时荧光强度最高,MOI值为800;Tbx18实验组Western-blot检测到69KD大小的Tbx18蛋白,空白对照组和阴性对照组均无Tbx18蛋白表达;4、Tbx18感染小鼠CSCs后第6天,qPCR、Westeron-blot检测显示,空白对照组、阴性对照组和Tbx18实验组均未检测到HCN4在mRNA水平和蛋白水平的表达。结论:1、组织块贴壁培养法获得小鼠CSCs是稳定、可靠的,C-kit+CSCs占原代心脏干细胞总数的75%;2.成功构建Tbx18重组腺病毒;3、Tbx18重组腺病毒成功感染CSCs,最佳MOI为800;4、上调Tbx18在CSCs的表达未能诱导其向起搏样细胞分化。