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米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)是我国近海常见的一种有害甲藻,常形成大规模的有害藻华(HABs),不仅影响到到海洋生态系统的稳定,也严重威胁到水产养殖以及人类健康甚至威胁生命。尽管在米氏凯伦藻生理生态及藻华形成的生态学和海洋学机制等方面开展了一些工作,但有关米氏凯伦藻细胞膜蛋白质组及其对环境变动的响应方面尚未有研究。 本论文以米氏凯伦藻为研究对象,建立了米氏凯伦藻细胞表面膜蛋白质荧光标记技术和细胞膜蛋白质提取方法,运用鸟枪(Shotgun)蛋白质组技术、传统凝胶电泳(2-D)和荧光差异凝胶电泳技术(2-D DIGE)对膜蛋白质进行了分析,研究了米氏凯伦藻对环境温度变动的蛋白质组响应。主要研究结果如下: (1)建立了米氏凯伦藻细胞表面膜蛋白质荧光标记方法,确认了44个细胞表面膜蛋白质,成功鉴定到27个蛋白质,并对其功能进行了注释分析,主要为转运蛋白和热休克蛋白,它们在细胞适应低温方面具有一定的作用; (2)建立了一种简单有效的用于低丰度、难溶性膜蛋白质提取方法:Trizol提取方法虽然能够得到较多的可鉴定蛋白质,但是对于疏水性较强、跨膜结构较多的蛋白质,顺序提取法则具有更高的提取效率。此外,Trizol提取法和顺序提取法所提取的蛋白质图谱及蛋白质种类间存在较大差异。因此对于膜蛋白质组进行研究时,可以将两者结合运用,以获得更多蛋白质信息; (3)米氏凯伦藻在20℃条件下的细胞生长和光合作用要明显好于16℃和12℃,但它们在16℃和12℃条件下的差别不大,表明20℃比较有利于米氏凯伦藻的生长。米氏凯伦藻从12℃快速转移至16℃和20℃条件下时,藻细胞会出现短暂死亡及光合作用下降的现象,但随后细胞会快速适应温度的变化; (4)运用基于凝胶的定量蛋白质组学技术(2-D DIGE)结合MALDI-TOF/TOFMS质谱分析,比较了米氏凯伦藻在20℃、16℃和12℃三个温度条件下的蛋白质表达谱,发现82个蛋白质的表达存在显著差异,其中57个蛋白质获得有效注释。这些蛋白质在细胞适应环境温度变化方面起着重要作用。低温条件下蛋白质合成过程加强,这可能是细胞补偿因温度下降而导致的蛋白质错误折叠及降解。此外,与光合作用、呼吸作用以及转运相关的蛋白质表达上调,可能与低温导致的代谢酶活性下降有关。