【摘 要】
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实验目的:子宫内膜癌通常与能量代谢紊乱有关,探讨子宫内膜癌细胞中能量代谢的作用机制对治疗子宫内膜癌具有重要意义。而丝氨酸作为人体内的八种非必需氨基酸之一,在人体内参与多种生理活动,可以为细胞增殖提供一碳单位、甘氨酸等,并在肿瘤进程中扮演重要角色。人体内的丝氨酸来源主要有两种途径:Ⅰ自身合成途径;Ⅱ通过外界环境摄取。磷酸甘油脱氢酶（phosphoglycerate dehydrogenase）是丝氨
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实验目的:子宫内膜癌通常与能量代谢紊乱有关,探讨子宫内膜癌细胞中能量代谢的作用机制对治疗子宫内膜癌具有重要意义。而丝氨酸作为人体内的八种非必需氨基酸之一,在人体内参与多种生理活动,可以为细胞增殖提供一碳单位、甘氨酸等,并在肿瘤进程中扮演重要角色。人体内的丝氨酸来源主要有两种途径:Ⅰ自身合成途径;Ⅱ通过外界环境摄取。磷酸甘油脱氢酶（phosphoglycerate dehydrogenase）是丝氨酸合成的第一个酶也是限速酶,丝氨酸羟甲基转移酶（serine hydroxymethyltransferase 2）主要分布于线粒体中,可以将甘氨酸转化为丝氨酸。研究发现在结直肠癌细胞中限制丝氨酸合成联合培养基中缺少丝氨酸/甘氨酸可以抑制肿瘤生长,但该项研究没有具体揭示当丝氨酸合成抑制后并联合培养基中缺少丝氨酸/甘氨酸后的作用机制。因此本课题主要阐述激活转录因子4（activating transcription factor 4）在丝氨酸/甘氨酸缺失后在子宫内膜癌中的作用机制,为丝氨酸研究提供一个新思路,也为子宫内膜癌的治疗提供一个新的方法和策略。实验方法:1.采用TCGA大数据分析人子宫内膜癌组织与癌旁组织中PHGDH蛋白表达量的区别,具体分析了13对病人的癌组织和癌旁组织中的PHGDH表达含量的区别。随后通过分析子宫内膜癌患者的总进展生存期和无进展生存期,检测PHGDH与子宫内膜癌患者预后的关系。2.在子宫内膜癌细胞中,通过Quantitative Real-time PCR实验和Western Blot实验检测子宫内膜癌细胞中丝氨酸合成关键酶表达含量。3.通过si RNA转染抑制PHGDH后,检测抑制PHGDH后对AN3CA增殖活性的影响。随后用PHGDH抑制剂NCT-503处理AN3CA和Ishikawa细胞,并用PHGDH低表达的HEC-1-A细胞作为对照,检测NCT-503对PHGDH依赖的子宫内膜癌细胞的影响。4.研究抑制丝氨酸合成并联合培养基中缺失丝氨酸/甘氨酸对子宫内膜癌细胞活性的影响。用缺失丝氨酸和缺失丝氨酸/甘氨酸的培养基联合不同浓度的NCT-503处理AN3CA细胞,检测其对子宫内膜癌细胞的影响。5.检测PHGDH抑制细胞增殖的作用机制。通过DCFH-DA法检测了抑制PHGDH对ROS的影响,并用ROS的清除剂TOC预处理后,用DCFH-DA法检测了在子宫内膜癌细胞中ROS的变化。6.探讨抑制丝氨酸合成联合培养基中缺少丝氨酸/甘氨酸对ROS的影响。用DCFH-DA法检测了抑制PHGDH联合培养基中缺少丝氨酸/甘氨酸对ROS的影响,用TOC预处理后,通过DCFH-DA法检测了其对ROS的影响;用MTT法检测了其对子宫内膜癌细胞活性的影响;用Annexin V-FITC/PI和Western Blot法检测了其对AN3CA细胞凋亡的影响。7.研究抑制丝氨酸合成途径并联合培养基中缺失丝氨酸/甘氨酸对子宫内膜癌细胞活性的影响。用MTT法检测加入NCT-503和SHIN1并联合培养基中缺少丝氨酸/甘氨酸对子宫内膜癌细胞增殖的影响,并用TOC预处理后检测了加入TOC后对子宫内膜癌细胞增殖的影响。8.检测在子宫内膜癌细胞中p53能否调控PHGDH。首先检测了在五株子宫内膜癌细胞中p53蛋白的表达情况,随后在p53高表达的HEC-1-A和HEC-1-B细胞用p53抑制剂Pifithrinα处理24 h后,检测了抑制p53后对PHGDH的影响,并且挑选了p53低表达的AN3CA和Ishikawa细胞用p53诱导剂Nutlin-3a处理24 h后,检测了诱导p53后对PHGDH的影响。9.研究在子宫内膜癌细胞中ATF4能否调控PHGDH:在AN3CA和Ishikawa细胞中用ATF4的si RNA处理,然后分别用Western Blot法和Quantitative Real-time PCR法检测了沉默ATF4后对PHGDH和SHMT2的蛋白水平和m RNA水平的影响。为了进一步验证,我们随后用ATF4高表达质粒转染两株细胞后,用Western Blot法和Quantitative Real-time PCR法检测了对PHGDH和SHMT2的影响。当缺失丝氨酸/甘氨酸后我们检测了ATF4、PHGDH和SHMT2的m RNA和蛋白表达含量的变化。实验结论:抑制PHGDH可以升高ROS,进而影响子宫内膜癌细胞的增殖和诱导子宫内膜癌细胞凋亡。在丝氨酸/甘氨酸缺失后抑制丝氨酸的合成可以有效抑制子宫内膜癌细胞的增殖,而ROS清除剂TOC则会逆转这种现象。缺失丝氨酸/甘氨酸后,会引起ATF4蛋白的升高,ATF4升高后进而会促进PHGDH和SHMT2蛋白表达量升高,从而促进细胞内的丝氨酸合成途径,以维持肿瘤细胞生长。
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