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聚类规律间隔短回文重复（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）是一种RNA引导的基因组编辑系统,现已被广泛应用于包括基因功能研究、疾病建模和疾病治疗等生物医学领域。该编辑系统使用一种单向导RNA（sg RNA）引导Cas9核酸酶到互补区域,使得Cas9切割已识别的DNA并产生双链断裂（DSBs）,导致特定目标基因组位点的插入或删除。CRISPR/Cas9基因组编辑系统因其简单、灵活、高特异性和高效率而彻底改变了基因组编辑方式。尽管Cas9/sg RNA技术潜力巨大,但其在癌症基因治疗中并不能完全发挥功效,主要挑战在于缺少能够有效、安全靶向肿瘤细胞的递送系统。为了将Cas9/sg RNA输送到脑部治疗脑肿瘤,需要进一步的靶向修饰来促进血脑屏障（BBB）的渗透,这是由于BBB阻止了几乎所有大分子药物和98%以上的小分子药物进入大脑。因此,为了实现脑肿瘤有效治疗必须克服血脑屏障。本文中,我们开发了尺寸小、包载效率高的CRISPR/Cas9脑递送纳米胶囊,通过将单个Cas9蛋白与sg RNA复合,并封装在表面还原响应聚合物外壳中,表面修饰上具有BBB穿透和肿瘤靶向的双重靶向配体。具体制备过程为,将Cas9/sg RNA复合物通过静电相互作用被带正电荷的丙烯酸酯胍包覆,并与N,N’-双（丙烯酰）半胱胺,丙烯酸酯和琥珀酸修饰的聚乙二醇（PEG）聚合交联,然后通过酰胺化反应在纳米胶囊表面装饰上末端为氨基的Angiopep-2多肽。其中Angiopep-2能与BBB内皮细胞和GBM肿瘤细胞表面高表达的低密度脂蛋白受体（LRP-1）特异结合,以促进BBB渗透和肿瘤细胞主动靶向。我们制备得到的纳米胶囊能实现有效的BBB渗透,优异的GBM肿瘤细胞主动靶向及胞内还原环境响应性触发释放。动态光散射（DLS）实验表明CRISPR/Cas9纳米胶囊平均水和粒径仅为31 nm,透射电子显微镜（TEM）显示了ANCSS（Cas9/sg RNA）的球形结构。细胞实验显示ANCSS（Cas9/sg RNA）的摄取分别是无靶向组和无还原敏感对照组的2.5倍和10.3倍,说明靶向分子Ang及还原基团的引入可显著提高了胶囊主动靶向性及细胞内响应释放。通过复合具有凋亡功能的sg PLK1后,体外的基因编辑实验证明在U87MG细胞中靶基因PLK1发生了36.6%基因突变,显著高于阳性对照转染试剂Lipo2000（14.8%）。蛋白印迹法结果显示,ANCSS（Cas9/sg PLK1）纳米胶囊可使PLK1蛋白表达显著低于其他各对照组。接下来我们通过药代动力学研究纳米胶囊是否能延长体内循环时间,结果表明ANCSS（Cas9/sg RNA）血液循环半衰期(t1/2,β)为57 min,与非靶向对照（53 min）和不可降解对照（56 min）无显著差异。而游离的Cas9/sg RNA在循环血液中被迅速清除(t1/2,β仅为5min),说明聚合壳在保护Cas9/sg RNA免于血液酶降解中起着至关重要的作用。活体成像结果显示ANCSS（Cas9/sg RNA）表明胶囊能有效渗透血脑屏障,并在肿瘤部位积聚和滞留。生物分布实验证明含有靶向PLK1的sg RNA的纳米胶囊可实现出色的胶质母细胞瘤组织靶向能力（每克组织含注射剂量的12%）。我们通过观察CRISPR/Cas9纳米胶囊对小鼠原位U87MG-Luc胶质母细胞瘤生长的影响,来评估其临床前抗脑胶质瘤（GBM）治疗效果。用ANCSS（Cas9/sg PLK1）纳米胶囊治疗的小鼠表现出明显的肿瘤生长抑制,表现出生物发光信号强度降低。生存曲线显示,纳米胶囊治疗后的生存时间显著延长,中位生存时间为68天,而ANCSS（Cas9/sg Scr）为24天,PBS治疗为22天。纳米胶囊处理的小鼠肿瘤组织的插入缺失频率为33.8%,用ANCSS（Cas9/sg Scr）或PBS处理时,PLK1未见明显的剪切。与使用标准GBM细胞系的异种移植模型相比,患者组织异种移植模型（PDX）更好地概括了GBM的临床特征。因此,我们探索了我们的纳米胶囊在患者来源的GBM干细胞（GSCs）异种移植模型中的抗肿瘤效果。与之前的小鼠模型一样,ANCSS（Cas9/sg PLK1）治疗显著抑制了肿瘤生长,在接受ANCSS（Cas9/sg PLK1）治疗的小鼠中,表现出发光强度降低。ANCSS（Cas9/sg PLK1）老鼠处理显示一个延长的平均存活率为55天,相比ANCSS（Cas9/sg Scr）（21 d）或PBS（21 d）老鼠。T7E1实验显示ANCSS（Cas9/sg PLK1）诱导高插入缺失频率为24.0%,并且肿瘤组织中PLK1蛋白表达的也显著减少。我们在肿瘤组织中鉴定了几个潜在的脱靶PLK1序列位点。T7E1检测显示,在使用ANCSS（Cas9/sg PLK1）治疗后,U87MG和CSC2 GSCs小鼠的肿瘤组织中,这些潜在位点的基因破坏的效率微不足道。由于纳米胶囊被肝和肾等网状内皮系统器官清除,我们评估了这些器官组织的脱靶基因。在这些肝脏或肾脏组织中几乎没有发现基因破坏。DNA测序证实了在U87MG和CSC2 GSCs耐受的小鼠中的这些观察结果。因此,我们的CRISPR/Cas9递送系统提供了安全且肿瘤特异性的基因编辑剂传递系统,改善了胶质母细胞瘤的治疗,并可能用于其他脑疾病。