研究背景目前,缺血性心肌病是人类死亡和致残的主要疾病之一。由于冠脉的狭窄和闭塞导致组织缺血和缺氧,伴随心绞痛、心梗、心律失常及心衰等症状,当心功能恶化到Ⅳ级时,1年死亡率可达60%。在过去几十年里,药物治疗、经皮冠状动脉腔内成形+支架术、冠状动脉搭桥术及心脏移植等已经显著改善了缺血性心肌病患者的预后。尽管这些治疗措施已经取得了很大的进步,但仍存在许多限制,因此,很多学者致力于干细胞移植的研究。心肌梗死的修复过程中常看到冠脉侧支循环的形成,侧支循环能够改善缺血心肌灌注,减少心肌坏死,恢复“冬眠”心肌细胞的活性,从而减少心功能障碍的发生。然而机体自身生成的新生血管往往不足以代偿冠脉闭塞诱发的心肌缺血。因此,刺激缺血区小血管生长,促进侧支循环的形成,完成缺血区血管的自我搭桥便成了十分诱人且似乎直观合理的治疗方法。近年来,随着对血管新生和血管生长因子研究的不断深入,治疗性血管新生已成为治疗缺血性心脏病的新方法。目前有关MSCs移植治疗心肌梗死的动物实验表明,MSCs植入损伤部位后可长期存活,并分化为具有心肌细胞特征的类心肌细胞,促进“血管新生”,改善血液动力学。但仍然存在着大量有待解决的问题。例如如何增加移植后的干细胞存活率；改善梗死区的微环境,增加迁移或归巢到梗死区干细胞的数量等。近来,对于miRNAs调控干细胞的发生发展、自我更新、分化、抗凋亡及炎症和血管新生等一系列生物过程知识的积累,有学者认为miRNAs可以作为干细胞移植治疗缺血性心肌病研究的一个新的切入点。MiRNA126是血管内皮上的特殊的MiRNA,它在心梗后的血管发生和维持血管的完整性起着重要作用。MiRNA126可通过细胞分裂素活化蛋白酶发信号给VEGF与FGF来起作用。Spred-1和PIK3R2/p85-b是对Ras/细胞分裂素活化蛋白酶的抑制因子,可被MiRNA126抑制,而Spred-1和PIK3R2/p85-b可能抑制ERKAKT途径从而抑制血管生成。因此,上调MiRNA126可减轻Spred-1和PIK3R2/p85-b对VEGF及FGF的抑制作用,有利于血管发生。我们推测MiRNA126通过对干细胞的调节可能为干细胞移植治疗缺血性心脏病开辟一条新途径。第一部分小鼠骨髓间充质干细胞的体外培养、诱导及鉴定研究目的建立小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离、培养方法,研究其在体外生长增殖的生物学特性及表型特征.研究方法应用60%的Percoll细胞分离液分离骨髓间质干细胞,接着进行培养和传代。应用MTT方法测定培养细胞的生长曲线,应用流式细胞仪测定细胞周期和鉴定培养细胞的纯度,同时成骨诱导分化及成脂诱导分化鉴定骨髓间质干细胞实验结果原代培养的BMSCs24小时内贴壁并伸展成多角形、梭形,前3天为相对抑制期,其后细胞增殖速度逐渐加快,呈对数形式,7天左右至平台期,细胞覆盖率达90%左右,约在2周内传至第3代时可到106个数量级细胞,能够满足细胞移植数量的需要,应用流式细胞仪检测BMSCs的标志,显示CD29, CD44阳性,而CD34, CD45阴性,符合BMSCs特征。实验结论本课题应用60%Percoll细胞分离液成功地分离和培养出较为均一的骨髓间质干细胞。骨髓间质干细胞体外培养生长稳定,传代后细胞生长较快,适应能力较强,细胞大多数处于静止期,增殖潜力巨大。第二部分MiR126转染小鼠骨髓间充质干细胞研究目的：1构建miR-126的慢病毒表达载体,包装生产重组慢病毒,并进行慢病毒滴度、活性测定。2包装生产重组慢病毒,慢病毒滴度、活性测定研究方法我们利用Gateway clone构建pDown-miR126及pLV.EX3d.P/puro-TRE> miRl26>IRES/eGFP。制备编码了慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其pLV/helper-SL3, pLV/helper-SL4, pLV/helper-SL5辅助包装原件载体质粒,三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提,重组质粒DNA进行去内毒素质粒提取后,与包装系统质粒混合物按Invitrogen公司Lipofectamine2000使用说明进行共转染293TN细胞,然后进行慢病毒的包装,包装完成之后进行重组慢病毒滴度检测。实验结果：(1)成功构建miR-126的慢病毒表达载体。(2)成功进行了LV-miR-126重组病毒的生产和滴度测定。(3)慢病毒感染293TN细胞后,能够大大增强目的基因的表达。实验结论：通过慢病毒途径可以有效增强miR-126在宿主细胞中的表达第三部分观察MiRNA126对ERKAKT调控作用研究目的：在MSCs中过表达miRNA126以观察其对ERKAKT的影响及体外诱导骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞。研究方法：总RNA提取是根据All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit生产厂家的说明进行,miR126的表达行quantitative real-time RT-PCR检测,测试miRNA以U6作为单拷贝基因对照。阴性对照组及控制组相比在过表达miRNA126的MSCs中ERKAKT的表达行Westernblot检测。在第3代,过表达miR-126骨髓间充质干细胞与骨髓间充质干细胞分别按1×109/L密度接种,加入含血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞因子的DMEM培养基向血管内皮细胞诱导分化,ECMatrixTM凝胶体外血管新生实验观察血管新生情况。实验结果：在过表达miRNA126的MSCs中ERKAKT表达明显增加及过表达miRNA126的MSCs中毛细血管密度明显增加。实验结论：在MSCs中过表达MiRNA126对ERKAKT具有调控作用,能促进干细胞分化为血管内皮细胞。第四部分骨髓间充质干细胞过表达MIR126移植通过AKT/ERK途径促血管新生及改善心脏功能研究目的：比较骨髓间充质干细胞过表达MIR126移植与单纯BM-MSCs移植在小鼠心梗模型中的促血管新生作用及其机制。研究方法：通过结扎C57小鼠冠状动脉前降支制备心肌梗死模型,C57小鼠随机分为3组：MIR126-MSC组(即过表达MIR126的MSCs移植,n=15),MSC组(单纯的MSCs移植,n=15)以及PBS对照组(注射PBS, n=15)。在术后14天,进行细胞移植。实验组每只C57小鼠接受总计5×106(0.1m1)个过表达MIR126骨髓间充质干细胞或MSCs,分成6个点注入C57小鼠缺血心肌；对照组注入同等体积的无菌PBS。6周后行组织学及超声检查。实验结果：细胞移植6周后,MSC组和MIR126-MSC组缺血肌肉组织的血管新生均明显增强,以MIR126-MSC组的毛细血管密度最高(P<0.01)。Western-blot结果显示,MSC组和MIR126-MSC组缺血肌肉组织中ERK1, AKT蛋白表达均明显高于PBS对照组,以MIR126-MSC组的表达量最高(P<0.05)。细胞移植6周后,组MiRNA126-MSCs组、BMSCs组心功能都较移植前有明显改善(p<0.05),而其中MiRNA126-MSCs细胞移植组EF、FS改善程度要明显好于单纯细胞移植组(P<0.05)。实验结论：与单纯的MSC细胞移植疗法相比,过表达MIR126骨髓间充质干细胞移植具有更强的促进血管新生和侧枝血管形成的能力。我们推测过表达MIR126骨髓间充质干细胞移植通过ERK/AKT途径改善心功能,MIR126可能为干细胞移植治疗缺血性心脏病开辟一条新途径。