【摘 要】
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目的:骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是骨科最常见的骨关节疾病,该病的发生发展与关节软骨的退变密切相关。加味阳和汤是治疗骨关节炎的有效经验方,但其具体作用机制尚未明确。氧化应激与炎症在OA的发生发展中起着关键作用,本实验通过在体和离体实验,从软骨细胞凋亡、抗氧化功能、外基质分泌和相关蛋白表达多角度观察加味阳和汤的干预作用,探究加味阳和汤对OA中氧化应激与炎症的调控机制。方法:1.观察
【基金项目】
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基金名称:江西中医药大学一流学科建设科研启动基金专项项目，课题名称:基于Wnt/NF-κB双信号通路观察阳虚痰瘀型膝骨痹病发病机制及加味阳和汤多靶点调控机理研究，课题编号:JXSYLXK-ZHYI012； 基金名称:江西省中医药管理局项目，课题名称:膝痹病临床研究基地，课题编号:2020GJ01； 基金名称:江西省科技厅省级科技计
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目的:骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是骨科最常见的骨关节疾病,该病的发生发展与关节软骨的退变密切相关。加味阳和汤是治疗骨关节炎的有效经验方,但其具体作用机制尚未明确。氧化应激与炎症在OA的发生发展中起着关键作用,本实验通过在体和离体实验,从软骨细胞凋亡、抗氧化功能、外基质分泌和相关蛋白表达多角度观察加味阳和汤的干预作用,探究加味阳和汤对OA中氧化应激与炎症的调控机制。方法:1.观察加味阳和汤对氧化应激损伤软骨细胞的保护作用研究。制备含药血清;分离大鼠软骨细胞,鉴定软骨细胞;构建氧化应激损伤细胞模型,观察应激损伤细胞表型。观察指标:（1）甲苯胺蓝染色和免疫荧光鉴定软骨细胞;（2）H2O2法诱导构建氧化损伤细胞模型,CCK8法检测细胞活力;（3）DCFH-DA荧光法检测ROS水平;（4）试剂盒检测SOD、MDA;（5）SA-β-Gal染色检测软骨细胞衰老;（6）ELISA检测各组细胞上清液炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达;（7）AO-EB染色、流式细胞术检测细胞凋亡;（8）阿尔新蓝染色和免疫荧光检测软骨分泌外基质功能。2.加味阳和汤对氧化损伤软骨细胞的保护作用机制探讨。Western blot检测Bcl-2、Bax、Keap1、p-Nrf2、Nrf2、HO-1、IKK、p-NF-κB、NF-κB和IKB-α蛋白表达。3.加味阳和汤对OA模型大鼠关节软骨的抗氧化保护作用研究。内侧半月板失稳造模OA大鼠,采用梯度加味阳和汤干预OA大鼠,观察小鼠关节软骨退变情况、抗氧化能力、相关蛋白表达。观察指标:（1）大体水平、Micro-CT、HE染色、番红-固绿染色切片观察关节退变情况;（2）Mankin评分和OARSI评分评价关节软骨退变情况;（3）试剂盒检测血清和关节液MDA和SOD;（4）免疫组化染色观察COL2A、MMP13、Nrf2、NF-κB表达;（5）Western blot检测Bcl-2、Bax、Keap1、p-Nrf2、Nrf2、HO-1、IKK、p-NF-κB、NF-κB和IKB-α蛋白表达。结果:1.在加味阳和汤含药血清进行干预来观察加味阳和汤对氧化损伤软骨细胞的保护作用的研究结果中发现H2O2对软骨细胞损伤有时间和剂量依赖性,其中400μmol·L-1 H2O2干预12h可以有效构建软骨氧化应激模型。加味阳和汤含药血清的预处理可以通过降低氧化损伤软骨细胞ROS和MDA的表达,上调SOD表达,有效减少了软骨细胞氧化应激损伤、细胞衰老和炎症的发生,减少了软骨细胞的凋亡并改善分泌细胞外基质的功能。2.在探究加味阳和汤对氧化损伤软骨细胞的保护作用机制的研究结果中发现加味阳和汤激活Nrf2信号通路的传导并抑制NF-κB信号通路的传导减少了软骨细胞氧化应激损伤、炎症和凋亡。3.在探究加味阳和汤对OA模型大鼠关节软骨的抗氧化保护作用研究结果中发现加味阳和汤激活Nrf2信号通路的传导并抑制NF-κB信号通路的传导减少了软骨细胞氧化应激损伤、炎症和凋亡,保护关节软骨,延缓了OA进展。结论:加味阳和汤激活Nrf2信号通路的传导并抑制NF-κB信号通路的传导减少了软骨细胞氧化应激损伤、炎症、衰老和凋亡,保护关节软骨,延缓了OA进展。
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