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第一部分TRPV4通道在心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤中的作用目的:近年研究表明TRPV4通道高表达于心脑血管系统,并在小鼠脑室和心脏缺血再灌注损伤过程中发挥重要作用,然而具体起关键作用的细胞和机制尚不明确。本文旨在探究TRPV4通道在心肌细胞H/R损伤中的作用。方法:分离培养乳大鼠心肌细胞(NRVMs)和大鼠心肌H9C2细胞系,构建细胞H/R模型,采用实时定量PCR以及western blot方法检测TRPV4通道的表达水平,利用Fluo-4/AM钙荧光染料观察心肌细胞对TRPV4特异性激动剂GSK1016790A的反应性。在复氧时给予TRPV4特异性激动/抑制剂干预,并用CCK-8和LDH试剂盒检测细胞损伤,AV/PI双染法检测细胞凋亡。此外,制备特异性的TRPV4-siRNA沉默TRPV4基因。结果:TRPV4通道在NRVMs和H9C2心肌细胞上均有mRNA和蛋白水平的表达,而且GSK1016790A呈浓度依赖性的诱导胞外钙离子内流,表明心肌细胞上TRPV4通道具有功能。H/R后NRVMs和H9C2心肌细胞上TRPV4通道在mRNA和蛋白水平的表达均明显增加,而且复氧后心肌细胞对GSK1016790A的钙反应敏感性明显增强,表明H/R后TRPV4通道表达增加,功能增强;同时HC-067047可以明显减轻H/R诱导的细胞损伤,表现为:恢复细胞活力,降低LDH释放活力以及减少细胞凋亡;反之,GSK1016790A可以进一步加重其损伤。此外,TRPV4-siRNA干预心肌细胞48h可以显著降低TRPV4在mRNA和蛋白水平的表达以及功能,并可以逆转H/R损伤。结论:TRPV4通道在心肌细胞上功能性的表达,而且H/R后TRPV4表达增加和功能增强,并在H/R过程中起关键作用。第二部分TRPV4通道在心肌细胞H/R损伤中的作用机制:钙超载、氧化应激和线粒体损伤目的:我们的研究证实TRPV4通道在小鼠心肌缺血/再灌注损伤和心肌细胞H/R中有重要作用,然而其详细作用机制未明。并且TRPV4活化后高通透钙离子,已有研究证实在内皮细胞、膀胱上皮细胞和神经细胞等多种细胞病理模型中激动TRPV4通道可以介导钙内流诱导胞浆内钙超载,促进胞浆内ROS的产生,进而导致线粒体功能紊乱介导细胞损伤。然而在心肌细胞尚无相关研究报道。因此本研究旨在探究TRPV4通道在心肌细胞H/R损伤中的相关作用机制:钙超载、氧化应激和线粒体损伤。方法:构建心肌细胞H/R模型,利用钙荧光技术观察心肌细胞胞浆内自由钙离子浓度。此外,心肌细胞胞浆DCFH-DA染色和线粒体膜电位JC-1荧光染色借助激光共聚焦定性观察拍照作图,并利用多功能酶标仪定量检测DCFH-DA的荧光密度和反映线粒体通透性转换孔开放的钙黄绿素平均荧光强度,以及线粒体膜电位(Δψm)改变的红/绿荧光强度比值。最后验证TRPV4基因沉默后对胞浆内自由钙浓度和ROS的影响,螯合胞外钙离子后对ROS产生的影响,应用ROS清除剂NAC对线粒体膜电位的改变和线粒体通透性转换孔开放的影响。结果:GSK1016790A可以进一步加重H/R诱导的胞浆内钙超载,ROS的增多,线粒体膜电位的去极化以及线粒体通透性转换孔的开放。反之,HC-067047逆转H/R诱导的这些指标变化。同时,TRPV4-si RNA干预心肌细胞后可以显著降低H/R导致的[Ca]i2+超载和ROS的释放量;螯合细胞外Ca2+后显著降低复氧后ROS的释放量,NAC可以逆转H/R后线粒体膜电位的去极化和减少线粒体通透性转换孔开放。结论:激活TRPV4通道诱导钙超载,加重氧化应激,导致线粒体功能紊乱加速心肌细胞H/R损伤;反之,抑制TRPV4通道可以通过抑制钙超载-氧化应激-线粒体通路减轻H/R损伤。提示:TRPV4通道有望成为心肌H/R损伤中新的治疗靶点。第三部分TRPV4通道介导心肌氧化应激损伤的作用及其具体机制目的:我们的研究发现药物抑制TRPV4通道或TRPV4基因敲除后在小鼠心肌缺血/再灌注损伤起保护作用。随后我们建立体外培养的心肌细胞H/R损伤模型证实了TRPV4活化后引起Ca2+内流,与随后的ROS释放,以及线粒体膜电位去极化和线粒体通透性转换孔的开放介导了H/R损伤。因而当前研究的目的是进一步探讨在心肌细胞H/R或外源性给予H2O2模拟在体心肌缺血再灌注损伤诱导氧化应激的作用及其具体机制。方法:构建心肌细胞H/R模型和H2O2诱导的大鼠心肌离体灌流模型和心肌细胞氧化应激损伤模型,采用CCK-8、LDH和AV/PI凋亡染色试剂盒检测细胞损伤,MDA检测试剂盒,以及SOD、GSH-PX1、CAT活性检测试剂盒分别检测相应酶活性。DCFHDA荧光染料利用激光共聚焦显微镜观察ROS的释放,并用多功能酶标仪定量检测ROS的相对含量和MDA的生成。最后利用western-blot方法检测P-AKT/AKT蛋白的比值变化,以及Nrf2的胞浆、胞核表达变化,并利用激光共聚焦观察Nrf2的表达变化;Real-time PCR检测Nrf2及其下游抗氧化反应元件(ARE):HO-1、NQO1、SOD2、GSH-PX1、CAT、GST和GCSH的m RNA水平表达变化。结果:H/R或者H2O2能够诱导明显的细胞损伤,表现为细胞活力的降低,乳酸脱氢酶(LDH)释放和细胞凋亡,而且ROS的释放和MDA的产生也明显增加,给予HC-067047或TRPV4-si RNA以及无钙培养液均可以减轻细胞损伤和减少ROS以及MDA的生成。同时,给予AKT抑制剂LY294002,HC-067047的保护作用消失。此外,H2O2刺激心肌细胞后TRPV4在m RNA和蛋白水平的表达增加,功能增强,钙超载加重;抑制TRPV4通道可以减轻[Ca]i2+超载。另外,HC-067047治疗后也增加P-AKT的表达和Nrf2的核转移及其下游抗氧化反应元件(ARE)主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和谷胱甘肽转移酶(GST)的m RNA水平增加和活力增强。LY294002能够完全阻断HC-067047的上述效应。最后,我们在动物水平验证TRPV4通道在小鼠心肌缺血再灌注损伤模型中的抗氧化应激作用。结论:抑制TRPV4通道减轻心肌氧化应激损伤的保护作用机制主要为上调AKT/Nrf2/ARE信号分子通路。