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2型糖尿病在全球范围内发病率明显增加,对人类健康构成巨大威胁。胰岛素抵抗与2型糖尿病等代谢性疾病密切相关,高脂饮食相关的慢性低度炎症是胰岛素抵抗发生的重要危险因素。Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）是一种重要的模式识别受体,与其相应配体结合后启动炎性信号通路,加速胰岛素抵抗进程。高脂饮食会诱发肠道菌群紊乱,破坏肠道屏障,加速细菌脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）释放入血,导致胰岛素抵抗的发生。为了证实TLR4是否参与了高脂饮食诱导的胰岛素抵抗,及其与肠道菌群紊乱的相关性,故本研究直接利用TLR4基因缺失小鼠,并建立高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠模型,探讨TLR4和肠道菌群是否存在相互作用共同导致胰岛素抵抗的发生。首先,采用PCR技术分别对野生型（Wild type,WT）小鼠和TLR4基因敲除(TLR4 knockout,TLR4-/-)小鼠进行基因型验证,验证得到小鼠品系为“TATTGGACAGCTTATA”前插入“1bp-T”的TLR4移码突变小鼠。采用高脂饮食诱导构建胰岛素抵抗模型后,对小鼠实施葡萄糖耐量实验（glucose tolerance test,GTT）实验,间隔一周后,进行胰岛素耐量实验（insulin tolerance test,ITT）。结果显示,与基础饮食组WT小鼠相比,高脂饮食组WT小鼠葡萄糖耐量和胰岛素敏感性明显降低（P＜0.05）,提示高脂饮食会导致胰岛素抵抗发生;而TLR4基因缺失能够明显改善小鼠糖耐量与胰岛素敏感性。为观察WT小鼠和TLR4基因缺失小鼠肠道菌群结构的变化,我们收集了四组小鼠的粪便进行16S r DNA测序。结果显示,四组总的操作分类单位（Operational Taxonomic Unit,OTU）个数有差异,提示肠道菌群结构存在差异;OTU主成分分析（Principal Components Analysis,PCA）分析显示,高脂饮食组WT小鼠和TLR4-/-小鼠,与基础饮食组WT小鼠和TLR4-/-小鼠的样本比较,在PCA1水平上呈现分散趋势,证明饮食条件对于菌群差异的贡献度为40.91%;在PCA2水平上,高脂饮食组WT小鼠和高脂饮食组TLR4-/-小鼠虽表现出分散的趋势,但TLR4基因的有无对于菌群差异的贡献度仅为16.33%,证明饮食条件是影响菌群差异的主要因素。根据OTU物种注释结果,在门水平上,四组之间有明显差异的菌门为厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门（P＜0.05）。与基础饮食组WT小鼠相比,高脂饮食组TLR4-/-小鼠和WT小鼠厚壁菌门和变形菌门均升高,拟杆菌门均降低（P＜0.05）;基础饮食组TLR4-/-小鼠菌门无明显变化。在属水平上,四组之间有明显差异的菌属为普雷沃菌属、假毛癣菌、脱硫弧菌属、拟普雷沃菌属、颤杆菌克属（P＜0.05）。与基础饮食组WT小鼠相比,高脂饮食组TLR4-/-小鼠和WT小鼠普雷沃菌属（Prevotella）和拟普雷沃菌属（Alloprevotella）均降低,假毛癣菌（Pseudoflavonifractor）、脱硫弧菌属（Desulfovibrio）和颤杆菌克属（Oscillibacter）均升高（P＜0.05）;在基础饮食组TLR4-/-小鼠样本中,除脱硫弧菌属（Desulfovibrio）（2.1%）、拟普雷沃菌属（Alloprevotella）（0.87%）这两种占比较低的菌属有差异外（P＜0.05）,其余菌属均无差异。提示高脂饮食是引起菌门和菌属变化的重要因素,TLR4基因缺失对菌门和菌属变化无影响。Alpha多样性分析显示,高脂饮食组WT小鼠、基础饮食组WT小鼠、高脂饮食组TLR4-/-小鼠和基础饮食组TLR4-/-小鼠sobs指数、chao1指数、ace指数有显著差异（P＜0.05）,而shannon指数、simpson指数以及覆盖率指数Good-coverage无明显差异（P＞0.05）。与基础饮食组WT小鼠相比,高脂饮食组TLR4-/-小鼠和WT小鼠的sobs指数、chao1指数、ace指数和Good-coverage指数有显著差异（P＜0.05）;基础饮食组TLR4-/-小鼠的指数均无明显差别。提示四组小鼠肠道菌群群落丰富度有明显差别,但群落多样性差异不明显,TLR4基因缺失对Alpha多样性无影响。Beta多样性分析显示,高脂饮食喂养WT小鼠与高脂饮食喂养TLR4-/-小鼠聚类到一起,基础饮食喂养WT小鼠与基础饮食喂养TLR4-/-小鼠聚类到一起,每组小鼠的样本也分别聚类到一起,提示组与组之间样本存在差异,同一组样本无差异。样品聚类树结果也提示饮食条件是影响菌群差异的主要因素。以上结果提示高脂饮食影响肠道菌群结构组成的变化,TLR4基因缺失不是菌群变化的影响因素。为了证实高脂饮食和TLR4信号对胰岛素信号通路的影响,我们利用Western Blotting技术检测了胰岛素作用的靶组织肝脏组织胰岛素信号通路关键信号分子蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）和胰岛素受体底物-1（insulin receptor substrate 1,IRS-1）磷酸化蛋白表达水平和总蛋白表达水平,结果显示,与基础饮食组WT小鼠比对,高脂饮食组WT小鼠肝脏p-Akt蛋白表达降低（P＜0.05）,总Akt蛋白表达无差异（P＞0.05）,p-Akt/Akt比值降低（P＜0.05）;而p-IRS1蛋白升高（P＜0.05）,IRS1总蛋白表达降低（P＜0.05）,p-IRS1/IRS1比值升高（P＜0.05）。基础饮食组WT小鼠、基础饮食组TLR4-/-小鼠和高脂饮食组TLR4-/-小鼠,三组之间肝脏组织p-Akt、Akt、p-IRS1和IRS1的表达水平均无差异。以上结果提示,TLR4基因的缺失,降低了高脂饮食对肝脏组织胰岛素信号通路关键信号分子p-Akt、Akt、p-IRS1和IRS1表达的影响。以上结果揭示TLR4基因缺失保护了小鼠免受高脂饮食诱导的胰岛素抵抗,而TLR4基因缺失并没有改变高脂饮食情况下肠道菌群的分布,那么,TLR4基因缺失是通过什么机制防止了高脂饮食诱导的胰岛素抵抗呢?为此,我们进一步检测了小鼠结肠组织中维护肠道屏障的重要蛋白-肠道紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1蛋白的表达水平,以观察肠道通透性的改变。Western Blotting检测结果显示与基础饮食组WT小鼠比对,高脂饮食组WT小鼠结肠组织Occludin和Claudin-1蛋白表达均降低（P＜0.05）;基础饮食组WT小鼠、基础饮食组TLR4-/-小鼠和高脂饮食组TLR4-/-小鼠,三组之间结肠组织Occludin和Claudin-1的表达水平均无差异。提示高脂饮食损伤了肠道屏障,肠道紧密连接蛋白表达下降;TLR4基因的缺失,降低了高脂饮食对结肠组织肠道通透性相关蛋白Occludin和Claudin-1表达的影响。综上,高脂饮食导致小鼠肠道菌群紊乱,破坏了肠道屏障功能,肝脏组织胰岛素信号通路关键信号分子Akt和IRS1磷酸化水平发生改变,导致胰岛素抵抗;TLR4可能没有参与高脂饮食诱导的肠道微生物群紊乱;TLR4基因缺失保护了小鼠免受高脂饮食诱导的胰岛素抵抗,其机制可能是通过TLR4维持肠道屏障的正常通透性而实现的。