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通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-32阴离子交换柱、Sephacryl S-300分子筛柱,从山麻鸭睾丸中提取出N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase,EC3.3.1.52,简称NAGase),比活力为5537.00 U/mg。提取的酶液经PAGE检测,呈现一条蛋白条带,经SDS-PAGE平板电泳呈现1种蛋白条带,亚基分子质量为67.60kD,等电点为5.05。以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖(pNP-NAG)为底物,进行酶催化底物水解的反应动力学研究,结果表明:山麻鸭睾丸NAGase催化底物反应的最适pH是5.70,在pH3.0~8.43区域较稳定;最适温度分别为45℃,酶活力在5℃~45℃的范围内保持稳定。睾丸NAGase水解pNP-NAG的反应符合米氏双曲线方程,水解pNP-NAG的米氏常数Km为0.17 mmol/L,最大反应速度Vm为8.82μmol/L/min,反应的活化能为57.57 kJ/mol。
研究金属离子对睾丸NAGase的影响,结果表明:低浓度(1~20mmol/L)的Na+对酶有激活作用。K+、Cu2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+和高浓度(0.02~1 mol/L)Na+对酶活力有不同程度的抑制作用。Cu2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+和高浓度K+对酶的抑制都表现为可逆非竞争性抑制类型,K+、Cu2+、Zn2+、Mg2+和Ca2+对酶的抑制常数KI分别为1.27 mol/L、20.91、40.43、1.95和108.12 mmol/L。
在特定浓度范围内,果糖、乳糖、葡萄糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖和蔗糖对睾丸NAGase活力有不同程度的抑制作用,果糖和乳糖的抑制作用较弱,葡萄糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖和蔗糖对酶的抑制作用强。葡萄糖对酶的抑制表现为可逆非竞争性类型,它的抑制常数K1为153.37 mmol/L;N-乙酰-D-氨基葡萄糖对酶的抑制类型是可逆混合型抑制类型,抑制常数KI与KIS分别为5.17和12.52 mmol/L;蔗糖对酶的抑制表现为可逆非竞争性类型,它的抑制常数KI为1.69mol/L。
研究常用的精液稀释液成份谷氨酸钠、柠檬酸钠、维生素C、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠对酶的作用,结果表明谷氨酸钠和磷酸二氢钠对山麻鸭睾丸NAGase有抑制作用;柠檬酸钠和磷酸氢二钠对酶活力的影响均是先激活后抑制;维生素C对酶有很强的激活作用。磷酸二氢钠和磷酸氢二钠对酶的抑制都属于可逆混合型抑制类型,抑制常数KI与KIS分别为36.55、210.7 mmol/L和94.65、273.06 mmol/L。
以非极性氨基酸:丙氨酸(L-Ala)、缬氨酸(L-Val)、苯丙氨酸(L-Phe)、蛋氨酸(L-Met)、脯氨酸(L-Pro);极性氨基酸:甘氨酸(L-Gly)、苏氨酸(L-Thr)、丝氨酸(L-Ser)、谷氨酰胺(L-Gln);碱性氨基酸:精氨酸(L-Arg)、组氨酸(L-His)和赖氨酸(L-Lys)作为效应物,测定氨基酸对山麻鸭睾丸NAGase活力的影响。L-Ala、L-Val、L-Phe、L-Met、L-Gly、L-Thr、L-Gln对酶活力有微弱的抑制作用;L-Ser对酶有微弱的激活作用;L-Pho、L-Arg、L-His、L-Lys对酶活力抑制作用较为明显。L-Pho和L-His对酶的抑制表现为可逆非竞争性类型,抑制常数KI分别为1.62和256.75mmol/L,L-Arg和L-Lys对酶的抑制表现为可逆反竞争性抑制,抑制常数KI分别为8.42和15.98 mmol/L。