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前言 中心体是哺乳类细胞主要的微管组织中心。它通过在细胞分裂时建立双极纺锤体、在有丝分裂期执行精确的染色体分离而保持基因组稳定。中心体复制周期的异常会导致单极或多极纺锤体的形成，后者一直被认为是染色体不稳定和肿瘤发生的原因。许多类型的肿瘤有这样一个特点，即大部分细胞有中心体异常，后者也被证明出现于肿瘤发生的早期阶段且随肿瘤进展。肿瘤中心体扩增与许多遗传改变相关，包括p53基因突变和STK15基因过表达。 在几乎所有人类肿瘤中都检测到了p53基因突变。在多数肿瘤中最常见的点突变发生于外显子5～8，在人喉鳞状细胞癌(ISCC)中亦如此。然而，对LSCC内含子突变研究却很少。内含子突变可以通过引起剪接异常或关键性DNA-蛋白反应中断而影响基因调控。内含子的嘧啶富集区[the polypyrimidine(py)tract]和支点一致序列(the branch point consensus sequence)中的任何突变都将通过干扰剪接体组装效率和mRNA前体(premRNA)的剪接直接影响剪接过程。p53蛋白功能受损将导致中心体异常，此过程可能通过p53蛋白的转激活-非依赖性(transactivation-independent)方式介导STK15蛋白过表达完成。 STK15(也称BTAK，Aurora-A)是人类丝氨酸／苏氨酸激酶15／胸部肿瘤扩增激酶，它对染色体分离和中心体功能都至关重要。在多种肿瘤中STK15基因都出现扩增，其转录本也有高表达。STK15过表达诱导中心体数目增多，异倍体形成和细胞转化。 为探讨p53基因内含子突变及其对p53蛋白表达的影响，以及p53基因突变和STK15基因异常表达相关性与喉癌中心体异常的关系，本研究应用PCR-SSCP银染结合DNA测序和Western Blot，检测了55例喉鳞癌患者的新鲜或冰冻肿瘤组织及配对正常组织的p53基因外显子7、8(p53E7和p53E8)、内含子7、8(p53I7和p53I8)的突变，及p53蛋白表达情况；同时对相同的55例配对标本用半定量RT-PCR方法检测STK15基因的表达情况；并结合实体瘤培养，对上述55例配对标本冰冻切片及实体瘤细胞用免疫荧光方法检测喉癌中心体扩增情况。本研究为探索喉癌发生机理，早期诊断和治疗提供了科学依据。实验材料与方法 1.实验材料 1 .1喉鳞状细胞癌组织标本 1.ZRT一PCR、PCR一SSCP及PCR产物纯化相关试剂 1.3 Westem Blot相关试剂 1 .4鼠抗，微管蛋白单克隆抗体、FITC偶联山羊抗鼠IgG及相关试剂 1.5实体瘤培养相关试剂 2.实验方法 2.1应用PCR一SSCP方法结合DNA测序检测上述55例配对组织必3基因第7、8外显子和第7、8内含子突变。 2.2应用Westem Blot方法检测上述55例配对组织p53蛋白表达情况。 2.3应用半定量RT一PCR方法，以癌旁正常组织为对照检测55例喉癌组织中STK15基因mRNA表达水平。 2.4应用免疫荧光方法检测上述55例配对组织冰冻切片及8例实体瘤细胞中心体扩增情况。实验结果 在55例喉癌组织中有17例(30.9%)存在p53基因第7外显子突变，有21例(38.2%)存在第7内含子突变。未检测到P53基因第8外显子和第8内含子突变。经统计学分析，肿瘤组织中户3E7和户317突变率均高于正常组织。p53I7突变主要发生于户3第7内含子3’一剪接受位的支点序列和喻吮富集区。 在55例喉癌组织中有40例(72.7%)存在户3蛋白表达异常，其中17例有p53基因第7外显子突变和21例存在第7内含子突变的肿瘤组织均发生了p53蛋白表达降低或电泳带位置迁移。 55例喉癌组织中有38例(69.1%)存在STK巧基因第8、9外显子mR-NA高表达，经统计学分析，肿瘤组与对照组差异显著。 38例癌组织STK巧基因出现高表达的病例中，有28例(73.7%)出现p53蛋白表达异常，有26例(68.4%)出现户3基因突变，其中14例(36.8%)为P53E7突变，14例(36.8%)为户3n突变，2例(5.3%)在户3E7和苗317均有突变。36例有苗3基因突变的病例中，有26例(72.2%)出现癌组织STK巧基因高表达。同时发生p53基因突变和STK15基因高表达的概率(47.2%)，高于仅发生声3基因突变的概率(18.2%)，高于仅发生STK巧基因高表达的概率(21.8%)。 55例配对组织冰冻切片及8例实体瘤细胞中心体扩增明显:中心体数目变化范围为1一6，有中心体扩增的细胞(即中心体数目>2)为13一20%，明显高于正常组织。讨论 一、肿瘤中p53基因及蛋白的异常 野生型卢3被称为“基因组卫士”，它通过对包括DNA损伤，微管断裂，调控点错误以及由癌基因激活产生的遗传改变进行反应，在保持基因组稳定性中起关键作用。p53蛋白位于有丝分裂期纺锤体和中心体上，并对调节中心体功能有重要作用。户3蛋白功能失调可以通过中心体异常扩增及染色体不稳定而导致肿瘤发生。 P53基因是人类肿瘤中最重要的抑癌基因之一，在包括喉癌的大多数肿瘤中都有该基因突变，且突变热点在p53基因的5一8外显子。然而，喉鳞状细胞癌的户3基因内含子突变很少有报道，且近乎未知。实际上内含子突变可以通过引起剪接异常或关键性DNA一蛋白反应中断而影响基因调控。内含子的嗜吮富集区和支点一致序列中的任何突变都将?