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目的:探讨大气细颗粒物PM2.5水溶成分(water soluble PM2.5 extracts,WSPE)在体外模型中对HBE细胞的毒性效应,通过氧化应激激活p53-Noxa通路诱导细胞凋亡,探索WSPE暴露的可能细胞毒性机制及发病机制,为进一步认识河南地区大气PM2.5对呼吸系统危害的毒理机制提供理论和实验依据,指导进一步基础研究和临床干预。方法:1于2013年9月19日-25日期间,于郑州市非工业区使用大流量采样器,每天24h连续采集样品,把大气细颗粒物收集在石英纤维滤膜载体上,运用不同的方法分析郑州市PM2.5的指标,这些指标包括其质量浓度和化学成分。洗脱石英纤维滤膜收集细颗粒物,提取水溶性成分真空冷冻干燥保存用于后续实验。2 HBE细胞分别用设定浓度的WSPE染毒液(0、50、100、200、400、800μg/ml)暴露处理12h、24 h和48h,采用MTT法生长实验检测细胞存活率,观察WSPE对HBE细胞增殖的影响,确定后续实验的染毒剂量。3用0、50、100、200、400、800μg/ml WSPE染毒液暴露HBE细胞24h后,进行微核实验,观察WSPE对细胞的遗传毒性;进行Hochst染色,定型的观察观察wspe对细胞凋亡的影响;进行流式细胞术实验,观察wspe对细胞氧化应激和凋亡的影响。4采用400mg/lwspe作为染毒剂,将实验分为十组:(1)空白对照组;(2)wspe组;(3)wspe+nac组;(4)nac组;(5)pft-α+nac组;(6)pft-α组;(7)wspe+noxa-sirna组;(8)noxa-sirna组;(9)wspe+nc-sirna组;(10)nc-sirna组。其中n乙酰半胱氨酸(nac)为活性氧抑制剂,pft-α为p53抑制剂,noxa-rna和nc-rna为sirna,合成并将其用脂质体转入hbe细胞中。5对实验组hbe细胞进行mtt生长实验,观察不同条件下细胞增殖的影响。6对实验组hbe细胞进行流式细胞术实验,观察不同条件对细胞氧化应激和凋亡的影响。7westernblot法检测目的蛋白p53和noxa的表达情况,以及caspase-3、caspase-9、cyt.c蛋白表达水平。8各组实验数据均以均数加减标准差(x±s)表示,采用spss12.0软件进行统计分析。多组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析(onewayanova)。独立样本两两比较采用lsd法,检测水准为α=0.05。结果:1郑州市高新区pm2.5的日均浓度变化范围为74.95–164.87μg/m3,日均值为122.76±30.01μg/m3。各种化学成分中碳元素和水溶性离子所占比重最大。2mtt生长实验的结果表明,12h、24h、48h时200、400、800mg/l染毒组对细胞存活率有明显抑制作用,差异有统计学意义(p<0.05)。用nac预处理细胞后,检测细胞存活率较染毒组明显升高,差异有统计学意义(p<0.05)。用pft-α预处理后检测细胞存活率较染毒组明显升高,差异有统计学意义(p<0.05)。3wspe(≥200mg/l)均可使hbe细胞微核率显著增高,对细胞的染色体产生不可逆损伤,差异均具有统计学意义(p<0.05)。4不同浓度染毒组对hbe细胞进行染毒24h,细胞内的活性氧(ros)含量随着染毒浓度的升高而增加,与空白对照组相比,差异有统计学意义(p<0.01)。用nac预处理细胞后,检测细胞dcf阳性率较染毒组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。用PFT-α预处理后检测细胞DCF阳性率较染毒组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。5不同浓度染毒组细胞凋亡率随浓度升高而升高,与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。用NAC预处理细胞后,检测细胞凋亡率较染毒组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。用PFT-α预处理后检测细胞凋亡率较染毒组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。6 Western blot分析结果表明,随着WSPE染毒时间延长,p53时间依赖性表达并下调Noxa。在WSPE染毒细胞中通过应用PFT-α、NAC凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-9和Cyt.c显著变化变化。同时和NC-siRNA组相比,缺失Noxa直接减少WSPE诱导的caspase-3和caspase-9表达,Cyt.c释放也受到抑制。结论:WSPE可以减低HBE细胞的存活率,导致染色体损伤,通过p53-Noxa通路介导的ROS产生诱导细胞凋亡。