研究背景:银屑病是皮肤科常见的红斑鳞屑性疾病,具有难治性、慢性及复发性,已成为皮肤科具有代表性的常见疾病,其主要病理学改变是角质形成细胞过度增殖,并有多种炎性细胞浸润。目前,银屑病的病因和发病机制尚未十分明确,但学者对免疫功能紊乱的观点普遍支持,其中KC在皮肤免疫中发挥着重要的作用。在炎症因子和外界因素的刺激下,KC可产生大量的细胞因子,包括TNF-α、IL-6、IL-1α、CCL20和抗菌肽等,因此,本研究利用不同的人类重组炎症因子蛋白和细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)干预HaCat细胞,以HaCat细胞为研究对象,一方面探讨HaCat炎症模型的生物学特性和细胞因子分泌特点,为银屑病的体外研究提供模型基础,从而进一步探索银屑病的发病机制。另一方面,分析各HaCat炎症模型的优势与限制,为模型选择及新模型的建立提供参考。MSCs是一类具有自我更新和向成骨、成脂和及成软骨分化潜能的干细胞,可以通过释放多种可溶性免疫调节因子的方式发挥强大的免疫调节作用,无论对自体还是同种异体的免疫细胞,无论对固有免疫细胞还是获得性免疫细胞都能发挥免疫调节作用[1],MSCs的疗法是治疗多种疾病有前景的工具。本研究以AMSCs和炎症性HaCat细胞模型为研究对象,采用qRT-PCR、细胞增殖实验等技术,探讨AMSCs及上清液对炎症性HaCat细胞模型分泌炎性细胞因子的影响,进一步探索MSCs对于银屑病KC免疫紊乱的调节机制,为临床使用MSCs疗法治疗银屑病提供理论依据。前期研究发现,银屑病患者AMSCs较健康人存在异常。本研究以补益药有效成分干预患者AMSCs,主要表现在黄芪甲苷对于炎症因子受体TLR3、TLR4的调控作用,而巴戟天寡糖提取物能够对于炎症因子和受体TGF-β、PD-L1起到调控作用,提示补益类中药可以通过调节银屑病AMSCs免疫功能,起到治疗银屑病作用。故本研究选取导师临床治疗银屑病的常用补益类中药提取物,进行体外机制研究,探讨其对银屑病AMSCs免疫调节功能的修复作用,为临床应用补益类中药治疗银屑病提供理论依据。目的:(1)探讨炎症性HaCat细胞模型的生物学特性和免疫细胞因子分泌特点,分析不同HaCat炎症模型刺激因子、不同作用浓度及不同作用时间的优势与限制,为银屑病体外HaCat炎症性模型的选择提供参考数据与理论基础。(2)探讨健康人AMSCs及其上清液对银屑病HaCat炎症模型分泌炎性细胞因子的影响,探索AMSCs治疗银屑病KC免疫紊乱的机制。(3)探讨补益类药物提取物ASIV与1FFN,对于银屑病AMSCs恢复免疫平衡,使其发挥正常AMSCs的免疫调节能力的作用。方法:(1)采用qRT-PCR的方法检测4种不同干预措施、每种干预措施的2-4种作用浓度,24h和48h作用时间下,HaCat炎症模型免疫细胞因子的分泌特点;采用CCK-8实验检测上述不同干预措施对HaCat炎症模型的增殖情况的影响。(2)体外分离培养健康AMSCs,培养至第2代备用;采用Transwell小室共培养的方式对AMSCs和HaCat炎症模型进行共同培养;采用qRT-PCR的方法检测健康AMSCs、健康AMSCs上清液对HaCat炎症模型的免疫细胞因子分泌特点的影响;采用qRT-PCR的方法检测健康AMSCs培养基、健康AMSCs处理组及对照未处理组HaCat所分泌的免疫细胞因子特点。(3)体外分离培养患者AMSCs,培养至第2代备用;采用补益药有效单体ASIV与1FFN干预银屑病AMSCs和健康AMSCs,筛选药物干预浓度;采用qRT-PCR的方法检测药物干预后银屑病AMSCs的免疫细胞因子分泌特点的影响;采用qRT-PCR的方法检测药物干预后健康AMSCs的免疫细胞因子分泌特点的影响;采用CCK-8实验检测上述不同药物对银屑病AMSCs的增殖情况的影响。结果:(1)当TNF-α刺激HaCat细胞24h后,产生炎症模型的表达情况如下:TNF-α、IL-1 α、IL-1 β、IL-8、IL-23 和 CCL20 mRNA 水平升高,具有显著差异(P<0.05)。当TNF-α刺激HaCat细胞48h后,产生炎症模型的表达情况如下:IL-1 α、IL-1 β、IL-17 和 CCL20 mRNA 水平升高,具有显著差异(P<0.05),48h炎症模型的表达情况中TNF-α、IL-8与IL-23与24 h不一致,考虑到这三者的反应时间较快,在24h达到高峰,经过48h其峰值降低,另外可能与干预处理的时间点有关,为了保证收样时的细胞量,24h处理组在细胞长满前24h进行干预,48h处理组在细胞长满前48h进行干预,最终选取24h为处理时间。同时,对4个浓度的人类重组蛋白TNF-α进行浓度筛选,分别是1Ong/ml、50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml,最终选定最佳浓度为100ng/ml。(2)对AMSCs和HaCat炎症模型进行Transwell小室共培养,比较健康AMSCs和健康AMSCs上清液对银屑病HaCat炎症模型分泌炎性细胞因子的影响,发现健康 AMSCs 共培养组,HaCat 炎症模型中 TNF-α、IL-1 α、IL-1 β、IL-6、IL-8 mRNA水平均得到降低,具有显著差异(P<0.05),从而调节HaCat细胞的炎症反应,提示以AMSCs进行局部皮损处理能够作为生物细胞疗法治疗银屑病的给药途径。同时检测健康AMSCs和AMSCs培养基对健康HaCat炎症因子水平影响较低,提示健康AMSCs干预组中AMSCs本身能够起到免疫调控能力,可排除AMSCs培养基的影响;健康AMSCs上清液组中AMSCs的外泌因子使HaCat模型分泌炎性因子水平增高,而AMSCs培养基的影响较弱。(3)高浓度组ASIV(60ul/ml)干预患者AMSCs时,TLR3、TLR4的上调具有显著差异(P<0.05);中、高浓度组1FFN(56ul/ml、112ul/ml)干预患者AMSCs时,TGF-β、PD-L1的上调具有显著差异(P<0.05);ASIV与1FFN对银屑病患者AMSCs增殖能力无影响,不具有细胞毒作用;当用不同浓度ASIV和1FFN干预健康 AMSCs 时,TLR3、TLR4、TGF-β、PD-L1 均无显著变化(P>0.05)。结论:(1)以TNF-α处理HaCat细胞24h建立HaCat炎症模型为最佳方法,最佳浓度是100ng/ml,最合适的干预时间为24h,且对HaCat细胞的增殖能力无影响。(2)健康AMSCs能够降低HaCat炎症模型的炎症因子水平,从而调节HaCat细胞的炎症反应,提示以AMSCs进行局部皮损处理能够作为生物细胞疗法治疗银屑病的给药途径;健康AMSCs对健康HaCat的炎症因子调节能力较低,对健康HaCat的免疫影响较低;健康AMSCs上清液不能够降低HaCat炎症模型的炎症因子水平,对HaCat细胞的免疫反应无调节能力,在加重炎症因子的表达的问题上有待进一步探究,以提示健康AMSCs的外泌因子无治疗银屑病的作用;AMSCs培养基对健康HaCat炎症因子水平影响较低,提示健康AMSCs干预组中AMSCs本身能够起到免疫调控能力。(3)与健康人相比,银屑病患者AMSCs中免疫相关细胞因子和免疫相关受体低表达,其免疫功能受到抑制;对银屑病患者AMSCs,黄芪甲苷和巴戟天寡糖5聚糖能够调节其免疫相关因子和受体水平表达,从而使其免疫失衡得到恢复;对健康人AMSCs,黄芪甲苷和巴戟天寡糖5聚糖对其免疫相关因子及受体水平表达无作用,不影响其自身免疫平衡;与健康人AMSCs增殖能力相比,银屑病患者的AMSCs增殖能力减弱;黄芪甲苷和巴戟天寡糖5聚糖能够提高银屑病AMSCs的细胞增殖能力。