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柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)是一种系统性的毁灭性病害,其病原菌是专性寄生于韧皮部筛管组织中的革兰氏阴性细菌Candidatus Liberibacter,至今无法人工离体培养。其中,亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticu’,CLas)是危害全球柑橘产业的主要致病种。柑橘黄龙病给世界柑橘产业造成巨大损失,目前尚无有效根治方法,挖掘抗(感)病基因资源,培育抗病品种是解决柑橘黄龙病危害的根本途径。当黄龙病病原菌侵染植物时,胼胝质会大量沉积从而导致筛管阻塞,以防止病原菌进一步入侵。韧皮部蛋白2(Phloem Protein 2,PP2)是韧皮部中最丰富的蛋白质之一,有研究表明CsPP2基因可能参与黄龙病侵染引起的胼胝体沉积和筛管堵塞,但该类基因在柑橘中的功能研究鲜有报道。因此,本研究以黄龙病耐病酸柚和易感病锦橙为材料,研究柑橘CsPP2基因家族响应CLas侵染的表达谱,筛选与柑橘黄龙病侵染紧密相关的CsPP2基因,并通过柑橘转基因技术分析候选基因响应黄龙病菌侵染的生物学功能,为柑橘黄龙病抗病育种提供理论依据及新基因资源。具体研究结果如下:1、响应黄龙病菌侵染的CsPP2基因筛选与克隆以耐黄龙病的酸柚和易感病的锦橙为材料,qRT-PCR筛选获得6个响应黄龙病侵染的CsPP2基因:CsPP2B15、CsPP2B2、CsPP2A、CsPP2B12-1、CsPP2B10、CsPP2B12-2。克隆测序表明6个CsPP2具有典型的PP2结构域。qRT-PCR进一步分析表明,CsPP2B2在锦橙中上调表达,在酸柚嫩叶中表达几乎无变化;CsPP2A在锦橙和酸柚老叶上调表达,在酸柚嫩叶中无变化;CsPP2B12-1在锦橙和酸柚嫩叶叶脉中受HLB诱导上调表达;CsPP2B10在锦橙嫩叶上调表达,在酸柚中下调表达;CsPP2B12-2在锦橙和酸柚嫩叶叶脉中均上调表达;CsPP2B15在锦橙嫩叶中上调表达,在酸柚嫩叶中下调。在6个基因中,CsPP2B15受CLas诱导上调表达水平显著高于其它5个基因,且嫩叶和嫩梢是柑橘响应黄龙病侵染的早期原初侵染部位,由此推测CsPP2B15可能参与HLB侵染的早期阶段,且与柑橘品种感病性紧密相关。据此,本研究选取CsPP2B15开展进一步研究。2、CsPP2B15启动子的克隆与表达特性分析克隆获得长为992bp的CsPP2B15启动子,含多个潜在的受病原菌诱导(如W2 box、GT1 box、dof box、G box等)和参与逆境和植物激素应答相关(如ABRE、AuxRR-core、HSE等)的顺式作用元件以及参与防卫和应激反应的顺式作用元件TC-rich repeats。为了进一步确定CsPP2B15启动子的组织特异性,本研究构建了CsPP2B15启动子控制GUS报告基因的植物表达载体,转化枳[Poncirus trifoliata(L.)Raf.]上胚轴。GUS组织化学染色和酶活性测定均表明,CsPP2B15启动子具有较强的韧皮部组织特异性。3、超量表达CsPP2B15对柑橘响应黄龙病侵染的影响为进一步确定CsPP2B15对柑橘黄龙病的影响,以超量表达启动子CaMV35S为调控元件,构建CsPP2B15植物表达载体,农杆菌介导法转化柑橘,PCR等方法筛选获得12株超量表达CsPP2B15转基因植株,利用叶圆片嫁接传毒技术评价转基因植株响应CLas菌侵染的变化情况。结果表明,与非转基因植株相比,转基因植株中病原菌含量明显升高,胼胝体明显增加,韧皮部明显变厚。这些结果表明超量表达CsPP2B15可以促进病原菌的扩散和黄龙病症状的发生。综上所述,实验结果表明CsPP2B15与柑橘黄龙病感病性紧密相关,在病原菌增殖和症状发生中起着正向调控作用,可以作为柑橘抗黄龙病分子育种的一个重要候选基因,具有较大的应用价值。