转录因子Broad Complex（BR-C）是昆虫蜕皮激素（20-hydroxyecdysone,20E）信号通路下游关键的初级应答因子之一,其通过调控下游靶基因的转录表达而将20E信号传递到次级应答基因,进而参与调节昆虫幼虫向蛹的转变以及蛹向成虫转变。目前,关于BR-C的功能及其发挥转录调控功能的作用机制已经研究得较为清楚,但是除了已知的少数几个WCP基因和Vg基因外,在转录水平受昆虫BR-C转录因子直接调控的下游靶基因近年来并无新的发现。前期研究中,我们基于染色质免疫共沉淀测序（ChIP-Seq）分析在家蚕全基因组范围内筛选获得BR-C的潜在靶基因,其中Shatterred（Shtd）基因与细胞周期进程调控相关。本研究中,我们对家蚕Shtd基因进行了克隆分析,综合利用ChIP-PCR、EMSA和双荧光素酶活分析等方法在分子和细胞水平系统分析了BR-C对Shtd转录的直接调控作用,并在个体及组织水平探究了家蚕和果蝇BR-C及Shtd对翅原基生长发育的调控作用。获得的主要结果如下:1.家蚕Shatterred（Shtd）基因的全长cDNA序列克隆与表达谱分析ChIP-Seq数据显示,家蚕BR-C转录因子可与Shtd基因（基因编号BMgn008276）的启动子区特异结合,暗示Shtd基因可能是家蚕BR-C的靶基因。我们从家蚕翅原基中克隆获得了家蚕Shtd基因的全长cDNA序列,该序列全长6404bp,包含16个外显子和15个内含子;其所编码的氨基酸序列包含一个典型的ANAPC1结构域。通过对家蚕、果蝇、赤拟谷盗以及人等多个物种Shtd蛋白的ANAPC1结构域序列进行多序列比对,发现家蚕与其他物种Shtd的ANAPC1结构域的氨基酸序列高度相似,暗示不同物种间的Shtd具有相对保守的功能。以不同物种Shtd基因编码的氨基酸序列为基序构建的系统发生树显示,家蚕的Shtd与斜纹夜蛾亲缘关系较近,和哺乳动物亲缘关系较远。基于qRT-PCR方法分析了家蚕Shtd基因的时空表达谱。结果显示,家蚕Shtd基因在幼虫5龄第3天的翅原基、生殖腺和血淋巴等进行有丝分裂的组织中相对高表达,而在脂肪体和丝腺等进行核内周期的组织中表达量相对较低,暗示家蚕Shtd在细胞周期调控中发挥重要的作用。翅原基中的表达谱分析显示,在家蚕幼虫向蛹的转变过程中,Shtd在起蚕期的表达水平较高,而在幼虫末期及预蛹期低表达。鉴于翅原基在幼虫向蛹的转变过程中发生细胞增殖和生长,我们的结果暗示Shtd对翅原基中的细胞周期进程具有抑制作用。2.家蚕BR-C对Shtd基因转录的直接调控作用昆虫BR-C是一类含有锌指结构的转录因子,我们分析了家蚕BR-C对Shtd基因转录的调控作用。ChIP-Seq数据分析表明,家蚕BR-C在Shtd基因启动子区有一个ChIP峰。以该ChIP峰的序列为模板设计特异性引物和探针,并利用ChIP-PCR以及凝胶阻滞分析（EMSA）等实验检测BR-C与Shtd启动子的直接结合特性。ChIP-PCR结果显示,家蚕BR-C在家蚕胚胎来源的Bm E细胞以及上簇时期的翅原基中均可以与Shtd基因启动子区的ChIP峰结合;进一步的EMSA实验在体外也证实家蚕BR-C可与Shtd启动子区直接结合。我们克隆了家蚕Shtd基因的启动子,并采用荧光素酶报告基因实验分析了家蚕BR-C对Shtd基因启动子活性的调控作用。家蚕Bm E细胞中的分析结果显示,和对照相比,家蚕BR-C过表达可以显著下调Shtd全长启动子的活性;当Shtd启动子中含有BR-C潜在结合基序的片段被截去后,截短启动子丧失了对家蚕BR-C过表达的应答。考虑到BR-C和Shtd基因在家蚕不同发育阶段翅原基中的表达变化趋势相反,我们推测家蚕BR-C直接结合Shtd启动子并抑制其转录活性。3.BR-C及Shtd对家蚕和果蝇翅原基生长发育的影响我们采用RNAi技术探究了BR-C及Shtd对家蚕和果蝇翅原基生长发育的影响。针对家蚕BR-C和Shtd基因设计并合成双链RNA（ds RNA）,在家蚕幼虫5龄第5天和5龄第7天连续注射BR-C的ds RNA,在家蚕幼虫5龄初期和5龄第3天连续注射Shtd的ds RNA。第二次注射后24小时分离翅原基组织并进行qRT-PCR分析,结果显示,与对照相比,BR-C和Shtd的转录表达水平明显下调,而且BR-C的RNAi显著上调Shtd的转录表达水平,这进一步在个体水平上说明家蚕BR-C抑制Shtd的转录。表型分析发现,家蚕BR-C的RNAi导致家蚕不能正常化蛹,而家蚕Shtd的RNAi个体虽然可以成功化蛹并羽化为成虫,但成虫的翅出现明显的卷曲畸形并变小等异常表型。果蝇中的实验发现,由果蝇翅原基特异的Nubbin-Gal4和En-Gal4驱动的BR-C和Shtd基因在翅原基中的特异性RNAi同样分别导致蛹死亡和成虫翅发育异常。我们进一步在组织水平分析了BR-C和Shtd基因RNAi是否影响家蚕和果蝇翅原基细胞的细胞周期进程。5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷（Ed U）标记可以反映细胞周期S期的DNA复制现象;Ed U染色结果显示,和对照相比,家蚕BR-C的RNAi或果蝇BR-C的翅原基特异性RNAi均抑制翅原基细胞中的DNA复制,而Shtd的RNAi则使翅原基细胞中的DNA复制增强。磷酸化的组蛋白H3（pH3）通常用于标记细胞周期的M期;免疫荧光实验结果显示,家蚕个体和果蝇翅原基中BR-C的RNAi均导致翅原基中pH3信号减弱,而Shtd的RNAi则明显增强pH3信号。进一步的Western Blot结果表明,BR-C的RNAi能下调细胞周期蛋白CycE和CycB的水平,而Shtd的RNAi则与之相反。综合分析表明,昆虫转录因子BR-C通过与Shtd基因启动子直接结合来抑制其转录表达,进而通过影响细胞周期蛋白CycE和CycB的水平来调节翅原基中的细胞周期进程。