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背景:胃癌(gastric cancer,GC)是我国常见的恶性肿瘤之一,主要起源于胃黏膜上皮,其发病率在各种恶性肿瘤中居首位。由于GC早期不易被诊出,因此确诊时多数患者已经发展为GC中晚期。化疗是GC最重要的非手术治疗方法,然而由于肿瘤细胞对化疗药物耐药性的产生,使GC患者的临床化疗疗效降低。因此,探究GC细胞化疗耐药性的分子机制可为临床克服GC细胞耐药性提供新视角,改善GC患者的预后。
环状RNA(Circular RNA,circRNA)与传统的线性RNA(LinearRNA,含5’和3’末端)不同,circRNA不易被RNA外切酶降解,在细胞中更加稳定,这是由其分子呈封闭的环状结构决定的。近年来多项研究表明circRNA与GC的发生和发展密切相关,且参与肿瘤细胞化疗过程中耐药性的产生。然而,circCACTIN(hsa_circ_0092303)在GC细胞化疗过程中耐药性的产生和发展过程中的作用尚不清楚,因此,我们研究circCACTIN在GC细胞化疗过程中耐药性的产生和发展过程中的作用,探讨其可能存在的机制,为克服GC患者的化疗耐药性研究提供新视角。
目的:本课题通过在GC顺铂(Cisplatin,DDP)耐药细胞中沉默circCACTIN,探讨circCACTIN在GC细胞DDP耐药性的产生和发展过程中的作用,并初步探讨其作用机制,为circCACTIN作为GC抗药性靶向治疗的新靶点提供理论依据。
方法:
1.实时荧光定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)方法检测顺铂耐药的人胃腺癌细胞(AGS/DDP)和顺铂耐药的人未分化胃癌细胞(HGC-27/DDP)中经3’-5’核糖核酸外切酶(Ribonuclease R,RNase R)处理的磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和circCACTIN的表达水平,检测circCACTIN的细胞亚定位。
2.qRT-PCR检测40例GC患者癌旁和癌组织中circCACTIN的表达,qRT-PCR方法检测人胃黏膜上皮细胞GES-1和GC细胞(AGS、AGS/DDP、HGC-27和HGC-27/DDP)中circCACTIN的表达水平。
3.沉默circCACTIN后使用不同浓度(0、0.1、1、5、10、20、40、80、160μM)DDP分别处理AGS/DDP和HGC-27/DDP细胞48小时,采用细胞增殖毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8 , CCK-8 )和四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium , MTT )方法检测细胞活性。克隆形成实验检测AGS/DDP和HGC-27/DDP细胞的克隆形成能力。
4.流式细胞术检测不同组别(si-NC组和si-circCACTIN组)AGS/DDP和HGC-27/DDP细胞的凋亡水平;免疫印迹试验(Western Blot,WB)检测不同组别(si-NC组和si-circCACTIN组)AGS/DDP和HGC-27/DDP细胞中的凋亡相关蛋白cleavedcaspase-3和B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)的表达水平。
5.WB检测不同组别(si-NC组和si-circCACTIN组)AGS/DDP和HGC-27/DDP细胞的耐药相关蛋白——肺耐药相关蛋白(Lung resistance protein,LRP)、P-糖蛋白(P-glyco protein , P-gp )和多药耐药相关蛋白1(Multidrug resistance associated protein1,MRP1)的表达水平。
结果:
1.circCACTIN主要在AGS/DDP和HGC-27/DDP细胞质中表达。
2.40例GC患者癌组织中circCACTIN的表达水平明显高于其癌旁组织,其中相对于化疗敏感组,circCACTIN在化疗耐药组患者中的表达水平明显升高,差异具有统计学意义。与AGS细胞相比,circCACTIN在AGS/DDP细胞中表达升高;与HGC-27细胞相比,circCACTIN在HGC-27/DDP细胞中表达升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。
3.沉默circCACTIN能够增加AGS/DDP和HGC-27/DDP细胞对DDP的敏感性。
4.与si-NC组相比,在AGS/DDP和HGC-27/DDP细胞中沉默circCACTIN后细胞凋亡水平增加,差异具有统计学意义(P<0.01);与si-NC组相比,在AGS/DDP和HGC-27/DDP细胞中沉默circCACTIN后cleavedcaspase-3表达升高而Bcl-2表达降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。
5.与si-NC组相比,在AGS/DDP和HGC-27/DDP细胞中沉默circCACTIN后LRP、P-gp和MRP1蛋白表达明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。
结论:沉默circCACTIN可以增强AGS/DDP和HGC-27/DDP细胞对DDP的敏感性。
环状RNA(Circular RNA,circRNA)与传统的线性RNA(LinearRNA,含5’和3’末端)不同,circRNA不易被RNA外切酶降解,在细胞中更加稳定,这是由其分子呈封闭的环状结构决定的。近年来多项研究表明circRNA与GC的发生和发展密切相关,且参与肿瘤细胞化疗过程中耐药性的产生。然而,circCACTIN(hsa_circ_0092303)在GC细胞化疗过程中耐药性的产生和发展过程中的作用尚不清楚,因此,我们研究circCACTIN在GC细胞化疗过程中耐药性的产生和发展过程中的作用,探讨其可能存在的机制,为克服GC患者的化疗耐药性研究提供新视角。
目的:本课题通过在GC顺铂(Cisplatin,DDP)耐药细胞中沉默circCACTIN,探讨circCACTIN在GC细胞DDP耐药性的产生和发展过程中的作用,并初步探讨其作用机制,为circCACTIN作为GC抗药性靶向治疗的新靶点提供理论依据。
方法:
1.实时荧光定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)方法检测顺铂耐药的人胃腺癌细胞(AGS/DDP)和顺铂耐药的人未分化胃癌细胞(HGC-27/DDP)中经3’-5’核糖核酸外切酶(Ribonuclease R,RNase R)处理的磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和circCACTIN的表达水平,检测circCACTIN的细胞亚定位。
2.qRT-PCR检测40例GC患者癌旁和癌组织中circCACTIN的表达,qRT-PCR方法检测人胃黏膜上皮细胞GES-1和GC细胞(AGS、AGS/DDP、HGC-27和HGC-27/DDP)中circCACTIN的表达水平。
3.沉默circCACTIN后使用不同浓度(0、0.1、1、5、10、20、40、80、160μM)DDP分别处理AGS/DDP和HGC-27/DDP细胞48小时,采用细胞增殖毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8 , CCK-8 )和四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium , MTT )方法检测细胞活性。克隆形成实验检测AGS/DDP和HGC-27/DDP细胞的克隆形成能力。
4.流式细胞术检测不同组别(si-NC组和si-circCACTIN组)AGS/DDP和HGC-27/DDP细胞的凋亡水平;免疫印迹试验(Western Blot,WB)检测不同组别(si-NC组和si-circCACTIN组)AGS/DDP和HGC-27/DDP细胞中的凋亡相关蛋白cleavedcaspase-3和B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)的表达水平。
5.WB检测不同组别(si-NC组和si-circCACTIN组)AGS/DDP和HGC-27/DDP细胞的耐药相关蛋白——肺耐药相关蛋白(Lung resistance protein,LRP)、P-糖蛋白(P-glyco protein , P-gp )和多药耐药相关蛋白1(Multidrug resistance associated protein1,MRP1)的表达水平。
结果:
1.circCACTIN主要在AGS/DDP和HGC-27/DDP细胞质中表达。
2.40例GC患者癌组织中circCACTIN的表达水平明显高于其癌旁组织,其中相对于化疗敏感组,circCACTIN在化疗耐药组患者中的表达水平明显升高,差异具有统计学意义。与AGS细胞相比,circCACTIN在AGS/DDP细胞中表达升高;与HGC-27细胞相比,circCACTIN在HGC-27/DDP细胞中表达升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。
3.沉默circCACTIN能够增加AGS/DDP和HGC-27/DDP细胞对DDP的敏感性。
4.与si-NC组相比,在AGS/DDP和HGC-27/DDP细胞中沉默circCACTIN后细胞凋亡水平增加,差异具有统计学意义(P<0.01);与si-NC组相比,在AGS/DDP和HGC-27/DDP细胞中沉默circCACTIN后cleavedcaspase-3表达升高而Bcl-2表达降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。
5.与si-NC组相比,在AGS/DDP和HGC-27/DDP细胞中沉默circCACTIN后LRP、P-gp和MRP1蛋白表达明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。
结论:沉默circCACTIN可以增强AGS/DDP和HGC-27/DDP细胞对DDP的敏感性。