论文部分内容阅读
背景和目的:结直肠癌作为我国乃至全世界发生率及死亡率非常高的一种肿瘤性疾病,尽管目前关于它的诊断及治疗方式已经取得很大的进展,但是大部分结直肠癌患者在确诊时已经进展至中、晚期,并出现远处转移。因此发现结直肠癌的早期诊断及预后标志物对于患者来说变得越来越重要。本研究的目的筛选结直肠癌组织及正常组织之间异常表达的lncRNA,探索其中对结直肠癌患者生存预后及结直肠癌细胞系功能存在影响的lncRNA。本研究包括两部分:第一部分,通过生物信息学得到差异表达的lncRNA,筛选出目标lncRNA,分析该lncRNA与生存预后的关系及潜在的生物功能及可能参与的信号通路;第二部分,调控目标lncRNA表达对结直肠癌细胞系Hct116、HT29、SW480、SW620增殖、侵袭和迁移的影响。第一部分,lncRNA在结直肠癌中的表达、生存预后及潜在生物学功能。材料与方法1.下载TCGA数据库结直肠癌HTSeq-FPKM转录本数据,并通过perl语言对数据进行归纳整理;2.利用R语言“edgeR包”对647例结直肠癌组织与51例正常组织的lncRNA转录本进行差异分析,得到差异表达的lncRNA;3.对差异表达的lncRNA筛选得到的lncRNA-linc01977进行Wilcoxon秩和检验(非配对)和Wilcoxon符号秩检验(配对)、与临床分期的相关性、肿瘤组织相对正常组织的特异性、敏感性分析;4.对lncRNA-linc01977在所有肿瘤患者的表达以中位值为界,分为高、低表达组,运用Kaplan-Meier法log-rank检验对其进行生存分析;5.对HTSeq-FPKM转录本中的所有的mRNA与linc0 1977进行相关性分析(相关性系数>0.4),并对这些相关性mRNA进行GO(gene ontology)分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信号通路富集。除此之外,对这些相关mRNA进行PPI网络分析(最低要求互动得分-高置信度=0.700),筛选出最关键的10个mRNA。结果1.结直肠癌组织和正常组织之间lncRNA转录本差异表达分析结果显示1229个差异表达lncRNA,其中上调的有278个,下调951个;2.Wilcoxon秩和检验和Wilcoxon符号秩检验结果均显示lncRNA-linc01977在肿瘤组织的表达明显高于正常组织(P<0.001),结直肠癌中晚期患者(Ⅲ+Ⅳ)明显高于早期(Ⅰ+Ⅱ)(P<0.001);肿瘤组织表达相对于正常组织表达的lncRNA-linc01977特异性及敏感性分别为0.711及0.893,AUC值为0.86;3.高表达lncRNA-linc01977的结直肠癌患者比低表达linc01977的结直肠癌患者展示出更短的总生存时间(Over survival,OS)和无疾病生存期(Disease-free survival,DFS);4.根据筛查标准,得到696个与linc01977正负相关的mRNA,GO分析结果显示这些基因参与到的分子功能(Molecular Function,MF)包括:转移酶活性、甲基转移酶活性、S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶活性、N-甲基转移酶活性、蛋白质赖氨酸N-甲基转移酶活性、赖氨酸N-甲基转移酶活性;KEGG信号通路富集分析显示涉及的肿瘤信号相关通路包括:mTOR信号通路、VEGF信号通路、Notch信号通路、NF-kappa B信号通路,癌症中的胆碱代谢信息通路等。对相关基因进行PPI网络分析,按最低要求互动得分-高置信度(0.700),最终得到253个mRNA形成473条相互之间的关系网络,并利用Cytoscape3.6.3版及插件 cytoHubb 依 MCC 法找到前 10 个关键 mRNA(NAT10、DDX27、DDX56、RRP12、BYSL、RRS1、RBM19、NOL6、WDR74、ODF2);除此之外,我们还发现两个常见的肿瘤增殖标志物PCNA和KI67的mRNA与linc01977具有一定的相关性。第二部分 lncRNA-linc01977 表达对结直肠癌细胞系 Hctll6、HT29、SW480、SW620增殖、侵袭和迁移的影响。材料与方法1.RT-PCR检测 lncRNA-linc01977 在结直肠癌细胞系 Hctll6、HT29、SW480、SW620及正常结直肠黏膜上皮细胞FHC的表达情况;2.对在结直肠癌细胞表达较高lncRNA-linc01977的细胞珠(SW480、HT29)转染linc01977-siRNA来进行敲低,并验证转染效率;3.CCK-8试剂、DAPI和EDU染色、克隆形成实验检测下调linc01977对SW480、HT29细胞增殖能力的影响;4.划痕实验和Transwell实验用来检测下调linc01977对SW480、HT29细胞侵袭、迁移能力的影响。结果1.RT-PCR检测显示lncRNA-linc01977在人结直肠癌细胞株(Hctll6、SW620、SW480、HT29)中的相对表达量明显高于人正常结直肠黏膜上皮细胞(FHC)[(1.23±0.10)&(1.83±0.06)&(3.04±0.07)&(3.87±0.14)vs(0.98±0.13)],以SW480和HT29明显。2.SW480 细胞中 linc01977-siRNA1组、linc01977-siRNA2、linc01977-siRNA3 与Nc-si组比较,linc01977的相对表达水平分别为(0.35±0.17)、(0.21±0.06)、(0.37±0.08)和(1.01±0.11),这三组与NC-si组比较差异有统计学意义(p<0.05);HT29 细胞中 linc01977-siRNA1组、linc01977-siRNA2、linc01977-siRNA3 与NC-si组比较,lncRNA-linc01977的相对表达水平分别为(0.19±0.03)、(0.37±0.04)、(0.35±0.08)和(1.11±0.03),这三组与 NC-si 组比较差异有统计学意义(p<0.05),结果显示linc01977-siRNA有效下调了两株细胞中linc01977的表达,而转染NC-siRNA未影响lncRNA-linc01977的表达。3.CCK-8 实验显示转染 linc01977-siRNA2 的 SW480、HT29 后 24h、48h、72h,与NC-si对照组相比,linc01977-siRNA2的SW480、HT29细胞增殖能力明显低于NC-si对照组,差异有统计学意义(P<0.05),此外DAPI和EDU染色、克隆形成实验亦显示转染linc01977-siRNA2的SW480、HT29后24h,与NC-si对照组相比,转染linc01977-siRNA2的SW480、HT29细胞增殖能力明显低于NC-si对照组,差异有统计学意义(P<0.05),提示下调linc01977能够显著抑制结直癌细胞(SW480、HT29)的增殖能力。4.划痕实验和Transwell实验显示转染linc01977-siRNA2后,SW480细胞和HT29细胞对比NC-si对照组的迁移和侵袭能力降低(p<0.05)。结论linc01977可能通过多个肿瘤相关信号及肿瘤相关mRNA促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭及迁移发挥着促癌作用,并作为结直肠癌患者的预后因子为结直肠癌的发生、发展提供了理论依据。