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龙胆酸（2，5-二羟基苯甲酸）代谢途径是许多芳烃化合物代谢进入三羧酸循环的一条重要的途径。龙胆酸经龙胆酸1，2-双加氧酶(GDO)催化的开环反应的产物顺丁烯二酸单酰丙酮酸(MP)的后续代谢有两种代谢方式:一种是在顺丁烯二酸单酰丙酮酸异构酶的催化下形成反丁烯二酸单酰丙酮酸(FP)，FP再由反丁烯二酸单酰丙酮酸水解酶(FPH)催化下产生反丁烯二酸和丙酮酸并进入三羧酸循环;另一种代谢方式是MP不经异构直接水解形成顺丁烯二酸和丙酮酸。前者在多株不同类型的菌中有了分子水平的报道，而MP直接水解途径只有相关生化水平的研究，证明其存在于某些菌株中，但该条途径分子水平的相关信息到目前为止依然没有任何报道。
在Pseudomonas alcaligenes NCIMB9867中曾经有研究报道了有关龙胆酸代谢直接水解途径的MPH和顺丁烯二酸水合酶(MH)的纯化，随后又有两个有关龙胆酸代谢的xln和hbz基因簇序列的报道，但这两个基因簇上只鉴定了3-羟基苯甲酸6-单加氧酶以及龙胆酸1，2-双加氧酶的基因，而龙胆酸的开环产物MP如何继续代谢并进入三羧酸循环的尚无分子水平的研究。
本研究首先通过对hbz基因簇上感兴趣的基因进行生物信息学分析，在序列比对后我们对hbzF及hbzIJ基因编码的蛋白产生了兴趣并将其克隆到表达载体上，并在大肠杆菌中进行了表达和酶学功能鉴定。
hbzF编码的蛋白能够催化MP的直接水解，经HPLC及LC-MS分析确定其产物为顺丁烯二酸和丙酮酸。经纯化后的HbzF的SDS-PAGE及分子筛分析我们推测该蛋白在活性状态下为同源二聚体，随后我们对HbzF的酶动力学参数及酶学性质进行了测定分析。同时，通过反转录PCR及real-timePCR分析发现，hbzF基因与严格诱导型的GDO基因hbzE共同转录，在2.5mM3-羟基苯甲酸诱导下hbzF的转录水平有16倍的提高。这是首次在分子水平对MPH进行的研究，与最初的hbzF被注释为MPI基因完全不同的是，其氨基酸序列在进化上与FPH属于同一蛋白超家族，与目前已有功能验证的MPI所含有的保守结构域完全不同。
MP直接水解之后的产物顺丁烯二酸能够在MH的催化下形成D-苹果酸。通过对hbzIJ基因的克隆表达及酶学分析我们发现，HbzIJ具有MH活性，该蛋白与三羧酸循环中顺乌头酸酶属于同一蛋白家族。该蛋白在纯化后呈浅灰色并且失去酶活，而在加入相应浓度的Fe2+和S2-重建[4Fe-4S]簇后能够恢复部分酶活。过去已经在许多微生物中均发现了MH的存在，它能够特异性的催化顺丁烯二酸形成D-苹果酸，过去已经有许多有关利用微生物来转化顺丁烯二酸生产苹果酸的报道。本研究是首次在分子水平揭示MH编码基因的相关信息，在NCIMB9867中，该基因可能与龙胆酸代谢直接水解途径相关。
在研究MP直接水解途径的同时，我们对hbz基因簇上的hbzG基因也进行了功能验证并发现它是编码GSH依赖型MPI的基因。为了研究MP直接水解途径在该菌株中的作用，我们以获得的NCIMB9867自然突变的xln基因簇缺失株XM504为研究对象，通过基因敲除的手段分别获得了MPH和MPI缺陷株。通过对这两株缺陷株在3-羟基苯甲酸和龙胆酸中的生长分析我们发现，在XM504中龙胆酸代谢并最终进入三羧酸循环依赖的依然是MP异构后水解途径，而MP直接水解途径在生成D-苹果酸后不能够继续代谢，可能是因为缺少与D-苹果酸代谢相关的酶。