目的:HIV是一种能攻击人体免疫系统的病毒,它把人体免疫系统中最重要的CD4+T淋巴细胞作为攻击目标,以免疫系统功能耗竭、严重的免疫缺陷为结局,导致临床上艾滋病的发生。艾滋病是严重危害人类健康的一类疾病,目前尚无有效的治疗手段。本研究通过观察 HIV-1的调节基因 Nef对淋巴细胞增殖和Treg细胞产生的影响,探讨 HIV-1 Nef逃逸机体免疫监视功能可能存在的机制,为 HIV感染病人的治疗提供新思路。　　方法:(1)将质粒 pcDNA3.1(+)-Nef和pcDNA3.1(+)(阴性对照)转染 THP-1细胞,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、western blot、细胞免疫荧光等方法检测目的蛋白 HIV-1Nef在真核细胞内的表达及定位,利用流式细胞术(FCM)检测 THP-1-3.1和THP-1-Nef细胞表面 CD4分子的表达,以此来评价 Nef蛋白的生物学活性。(2)混合淋巴细胞共培养实验观察 HIV-1 Nef对淋巴细胞增殖和Treg细胞产生的影响。(3)通过 RT-PCR、FCM方法检测 HIV-1 Nef对 THP-1细胞 TLR2表达的影响。采用共转染法将 NF-κB荧光报告基因转染 THP-1-Nef和THP-1-3.1细胞,通过测定荧光值(RLU)进一步评价 TLR2蛋白的表达变化。(4)利用RNA干扰技术设计并构建靶向 TLR2基因的siRNA重组质粒,转染 THP-1-Nef细胞,通过 RT-PCR、FCM检测 siRNA序列对 TLR2基因表达的沉默效果。通过测定 NF-κB活性来验证其对 TLR2基因的生物学活性影响。(5)再次混合淋巴细胞共培养观察 TLR2基因在 HIV-1 Nef对淋巴细胞增殖和Treg细胞产生的影响过程中扮演的重要角色。　　结果:(1)建立稳定细胞株:通过 G418对转染细胞进行筛选获得稳定表达 Nef的THP-1细胞株和阴性细胞株 THP-1-3.1。RT-PCR显示转染 pcDNA3.1(+)-Nef质粒的THP-1细胞出现621bp条带,对照组 THP-1-3.1细胞无相应条带出现;western blot结果见转染 pcDNA3.1(+)-Nef质粒的THP-1细胞约27KDa处检测到目的条带,表明pcDNA3.1(+)-Nef表达正确;荧光显微镜下观察转染 pcDNA3.1(+)-Nef质粒的THP-1细胞表达的Nef蛋白定位于细胞质中。通过 FCM检测 CD4分子的表达,发现转染pcDNA3.1(+)-Nef质粒的THP-1细胞表面 CD4分子的表达显著低于对照组 THP-1-3.1细胞。(2)混合淋巴细胞共培养实验:THP-1-Nef细胞能抑制淋巴细胞的增殖,促进Treg细胞的产生。(3) HIV-1 Nef诱导 TLR2高表达:RT-PCR分析显示 THP-1-Nef细胞 TLR2 mRNA表达水平显著高于对照组细胞;流式图显示 THP-1-Nef细胞和THP-1-3.1细胞 TLR2阳性细胞百分率分别为61.2±6.5％,76.8±8.1％和10.5±1.425％, THP-1-Nef细胞的两个克隆相对对照组 THP-1-3.1细胞细胞膜表面 TLR2蛋白的表达有显著差异(**,P<0.01)。(4)构建靶向 TLR2基因的siRNA重组质粒,重组质粒转染THP-1-Nef细胞,经过潮霉素筛选获得稳定细胞株。RT-PCR和FCM分析显示构建的两个siRNA重组质粒均可有效下调 TLR2的表达,同时下调了NF-κB的活性。(5)通过 siRNA干扰 TLR2表达之后,将获得的稳定细胞株与人淋巴细胞 PBMC共培养,流式结果显示,转染了TLR2 siRNA重组质粒的THP-1-Nef细胞相对于转染了乱码siRNA重组质粒的THP-1-Nef细胞,其抑制PBMC增殖的功能有所回升,同时对 Treg细胞的增殖的影响也显著减轻。　　结论:本研究提示 HIV-1 Nef在诱导 Treg细胞产生和抑制淋巴细胞增殖方面发挥了重要作用,可能与 HIV-1病毒逃避机体的免疫攻击,降低机体的免疫调节功能相关。进一步研究发现 TLR2蛋白在 HIV-1 Nef诱导 Treg细胞产生和抑制淋巴细胞增殖过程中,发挥了主要功能,为 HIV-1病毒感染病人的治疗提供了新思路。