研究背景全球范围内,艾滋病疫情日益严重。艾滋病病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)经性传播是艾滋病流行的首要途径。全球90%的感染者是通过性传播而感染上HIV病毒的,其中女性感染者比例呈逐渐增加的趋势。为降低HIV性传播或性传播疾病采取了很多预防措施,包括禁欲、一夫一妻制、常规使用安全套以及男性包皮环切术。但是对于HIV高致病地区的妇女,由于社会、经济和文化因素不能有效利用上述预防措施。因此,开发有效的杀微生物剂来预防HIV的性接触传播是目前全球艾滋病预防的首要任务和重要课题。最近几年有关HIV-1病毒和细胞膜融合导致病毒基因组进入宿主细胞的分子过程已逐渐被阐明。在HIV的感染过程中,首先是HIV包被膜与靶细胞的细胞膜发生融合。HIV与靶细胞融合主要由包膜糖蛋白gp160(由包膜表面糖蛋白gp120和跨膜糖蛋白gp41非共价结合形成)介导。gp120与靶细胞上的CD4分子和辅助受体(趋化因子受体CCR5或CXCR4等)依次结合,导致gp41的构型发生改变,形成六股α-螺旋束核心结构,将病毒包膜与靶细胞膜拉近并发生融合,完成病毒进入靶细胞的感染过程。这些对病毒进入机制的研究使得干涉病毒进入的治疗和预防成为可能。阻断这一病毒生命周期中重要的环节将可能有效控制HIV的传播与繁殖,是目前开发杀微生物剂的主要策略。天然产物由于具有来源广泛、结构多样、有效和低毒等特点,使天然来源HIV进入抑制剂成为近年来研究和开发新型抗HIV-1药物的热点。茶黄素是红茶中的主要成分,是一类具有苯骈卓酚酮结构的物质。目前已发现并鉴定的茶黄素种类共有28种,其中茶黄素(TF或TF1)、茶黄素-3-没食子酸酯(TF-3-G或TF2A)、茶黄素-3’-没食子酸酯(TF-3’-G或TF2B)和茶黄素-3,3’-双没食子酸酯(TFDG或TF3)是4种最主要的茶黄素。目前国内外大量研究证实其具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗菌及抗增殖等作用,是一类极具开发潜力的天然产物。我们曾报道过红茶中的茶黄素单体成分能特异性地作用于gp41,抑制gp41六螺旋核心结构的形成。根据gp41晶体结构进行的计算机辅助药物模拟技术也表明TF3能结合到gp41的疏水性空穴中。茶叶作为千百年来的保健饮品,不仅来源广泛,而且安全性极高。因此,茶黄素衍生物没有全身的毒副作用,完全可以作为一种“杀微生物剂”(Microbiocide),用于预防通过性传播途径的HIV感染。另外,有研究表明茶黄素还是一类抗炎化合物。理想的杀微生物剂要具备安全、有效、使用方便和价格便宜四个最基本的性质。茶黄素衍生物的这些性质提示我们,其抑制HIV的作用机理明确,具有显著的优越性,可将其作为第二代杀微生物剂进行研究,用于预防HIV的性传播。尽管可以将上述茶黄素单体化合物作为杀微生物剂进行开发,但单体成分不稳定,且难于分离纯化。为此,我们制备了包含上述四种茶黄素单体(含量达到90%)的茶黄素衍生物,并证明其在酸性环境下(pH<6)性质非常稳定。健康女性的阴道环境维持在pH 4.0～5.0的酸性环境中,该环境有利于增强自然防御,因此茶黄素衍生物在酸性环境中稳定的性质更有利于将其开发为阴道用杀微生物剂。由此可见,茶黄素衍生物若开发成阴道用杀微生物剂预防HIV的性传播,将具有价廉、安全、稳定的优点。目的：本文研究茶黄素衍生物(包括TF1、TF2A、TF2B、TF3四种茶黄素,四种成分总含量为90%)抗HIV的作用机制。同时,将茶黄素衍生物(TF)制备为2%TF凝胶剂进行研究,从细胞水平和动物水平进行TF凝胶剂的有效性及安全性评价,为最终成功开发一种安全、有效、稳定的抗HIV杀微生物剂候选分子奠定基础。方法：1.由于茶黄素单体成分在中性或碱性环境中不稳定,且分离纯化的成本高。本研究以茶黄素衍生物(TF)为研究对象,用反相高效液相色谱法分析其所含成分。2. ELISA法检测TF对HIV-1实验室适应性病毒株和耐药株的抑制活性,同时采用XTT法评价TF对人免疫细胞的毒性。3.采用时间过程实验、细胞-细胞融合方法初步确定TF在病毒复制周期中的作用机制和药物靶点。4.用酶联免疫测定法(ELISA)、天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(N-PAGE)、分子排阻高效液相色谱法(SE-HPLC)检测其抑制HIV gp41六螺旋束结构形成的活性。检测TF抑制HIVgp120与CD4结合的活性。同时,检测TF对HIV逆转录酶的抑制活性。5.PAP251-286为衍生于精液中前列腺酸性磷酸酶(prostatic acidic phosphatase,PAP)的多肽,具有促进HIV感染的活性,被称为精液来源的病毒增强肽(semen-derived enhancer of viral infection, SEVI)。用透射电子显微镜观察PAP251-286形成的原纤维的显微结构,研究TF对于SEVI形成的淀粉样纤维的降解作用。6.比较TF在不同pH柠檬酸-磷酸缓冲溶液中的稳定性。7.在单因素考察的基础上,以规定时间的累积渗透量和TF凝胶剂粘度为指标,选取卡波姆浓度、氮酮、丙二醇的用量三个因素进行正交试验设计优化最佳处方。对TF凝胶剂的稳定性进行了初步研究,包括耐热实验、耐寒实验、离心实验。8.用XTT法检测2%TF凝胶对人永生化阴道细胞(VK2/E6E7, Ectl/E6E7 and End1/E6E7)的毒性。通过皮肤过敏性实验以及家兔阴道粘膜刺激性实验,对家兔阴道使用2%TF凝胶剂进行初步安全性评价。采用PCNA免疫组化评价家兔阴道组织的炎症。ELISA法检测家兔阴道灌洗液中促炎细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-a)和免疫调节细胞因子(IL-10和GM-CSF)的水平。9.采用HPLC法考察2%TF凝胶剂的体内吸收。结果：1.TF主要含有茶黄素(TF或TF1)、茶黄素-3-没食子酸酯(TF-3-G或TF2A)、茶黄素-3’-没食子酸酯(TF-3-G或TF2B)和茶黄素-3,3’-双没食子酸酯(TFDG或TF3)4种茶黄素。四种茶黄素的总含量为90%。2.TF能高效抑制多种HIV-1实验室病毒株包括HIV-1X4型和R5型病毒,而且对耐药株感染也有显著的抑制活性。表明TF具有极为广谱的抗病毒活性。通过细胞毒性试验证明TF对人免疫细胞无毒性。3.时间过程实验结果显示TF在病毒感染后2小时加入时,对病毒已无明显抑制活性,在病毒感后1小时之内加入时,才显示很强的抑制活性,表明TF作用于病毒生活周期的早期。加入TF后H9/HIV-1ⅢB和MT2细胞混合培养后融合形成大量合胞体数目明显减少,其抑制率随着剂量的加大而增加,IC50为1.788μg/ml,表明TF有效抑制HIV包膜介导的细胞融合。通过这两个实验我们可以推测TF通过抑制HIV包膜介导的细胞融合从而阻止HIV的进入。4.N36和C34是从HIV gp41的NHR和CHR区衍生出来的多肽,二者在体外能形成类似gp41NHR和CHR结合的螺旋结构。因此,抗gp41六螺旋束核心结构的活性可以用抑制N36和C34结合的作用来测定。首先,我们用ELISA法检测,结果发现TF具有较好的抑制HIV gp41六螺旋束结构形成作用,IC50为10.07μg/ml。随后我们应用了两种生物物理方法,即天然凝胶电泳(N-PAGE)和分子排阻高速液相色谱(SE-HPLC),对TF抑制六螺旋束结构形成活性进行进一步的确证。N-PAGE法能根据多肽的分子量和荷电特性对其进行分离,在加入TF后能够明显抑制gp41六螺旋束结构条带的形成,表明TF能够靶向HIV gp41并抑制六螺旋束结构形成,抑制强度与ELISA法的结果一致。应用SE-HPLC法检测TF对HIV gp41六螺旋束结构形成的抑制作用可通过比较六螺旋束峰的峰面积来确定。在加入TF后能够明显降低六螺旋束峰的峰面积,且强度与前面的ELISA法和N-PAGE法一致。这充分说明了TF能够作用于HIVgp41抑制其形成六螺旋束结构。HIV gp120与cD4结合是HIV进入的第一步。TF能显著抑制HIV gp120与cD4结合,并且是剂量依赖性,IC50为1.22μg/ml,比抑制gp41六螺旋束形成的IC50高10倍。TF在高浓度能有效抑制HIV逆转录酶而产生抗HIV的活性,IC50为34.88μg/ml。该IC50值比抑制HIVgp41六螺旋束结构和gp120-CD4相互作用要高30～300倍。5.人精液中的多肽PAP251-286,即SEVI,能形成淀粉样原纤维,促进HIV感染。因此,SEVI被认为是促进HIV性传播的主要因素。电镜下观察到PAP251-286在浓度为8 mg/ml能形成大量典型的淀粉样原纤维的结构并且能稳定存在36小时。TF在2mg/ml时能形成细小聚集物。TF与PAP251-286形成的原纤维37℃共同孵育36小时后,纤维结构明显破坏分解。表明TF能够破坏SEVI淀粉样原纤维的结构,从而阻止精液导致的HIV感染。6.当TF在pH 3-6的环境中,24小时内HPLC色谱峰没有明显的改变。相反,当TF在pH为7-9的环境中4小时后含量减少,且大部分TF在24小时后完全降解。表明TF在pH酸性环境中稳定。7.处方含有2%TF最适合临床前和临床研究。4%TF凝胶由于含有高浓度的有效成分使其长时间不能被吸收。正交试验设计优化的最佳处方为卡波姆974P浓度为1%,甘油浓度为0.75%,丙二醇浓度为15%(w／w)。所制凝胶pH为4.1～4.7。TF凝胶剂经体外释放过程符合Higuchi方程。TF凝胶剂在室温条件下稳定性良好。8.TF对3种人正常阴道及子宫颈组织上皮细胞的细胞毒性作用均很低,且选择指数超过100。TF凝胶未见皮肤过敏性。连续14天每天一次阴道给予2%TF凝胶1ml后进行组织病理学检测,结果与N-9凝胶组和安慰剂组进行比较,发现2%TF凝胶对家兔阴道粘膜组织无刺激性。阴道上皮细胞保持完整,镜下观察结果和阴性对照组比较无明显差别。而阳性药物对照组(N-9)家兔的阴道组织病理学镜检结果显示局部严重的血管充血、粘膜下层水肿、大量的炎性细胞浸润、粘膜表层上皮细胞脱落等改变,根据评分标准可判定为极重度刺激性。检测2%TF凝胶组给药前后阴道灌洗液中炎症细胞因子(IL-1β, IL-6, IL-8和TNF-a)以及免疫调节因子(IL-10和GM-CSF)的水平,与阴性对照组比较没有显著改变。表明2%TF凝胶局部给药有较好的安全性。2%TF凝胶组和安慰剂组家兔阴道组织切片所观察到的阴道上皮细胞和基质细胞核所表达的PCNA阳性细胞无明显差异,表明反复使用TF凝胶不会导致细胞炎症或者阴道上皮细胞的超常增生。9.2%TF凝胶单次阴道给药后不会产生系统吸收。然而,在给药1小时后的阴道灌洗液中检测到较高浓度的茶黄素。更为重要的是,即使是给药6小时以后,仍然有TF残留,表明TF可以作为每天只用1次的杀微生物剂进行研发。结论：通过对TF体外药效学研究,发现茶黄素衍生物(TF)具有广谱的抗HIV活性。TF可通过多种机制抑制HIV的复制,为多靶点的HIV进入抑制剂,包括抑制HIV gp41六股螺旋束结构的形成,阻止gp120与CD4的结合。在高浓度时,TF还能抑制HIV逆转录酶的活性。尤其值得注意的是,表明TF能够破坏SEVI形成的淀粉样原纤维,从而阻止精液导致的HIV感染。由此可见,TF抑制HIV的作用机理明确、来源广泛、价廉,若将其作为第二代杀微生物剂用于预防HIV的性传播,有显著的优越性和可行性。本研究进一步将TF制备为阴道用凝胶剂,确定最佳处方为TF为2%,卡波姆974P浓度为1%,甘油浓度为0.75%,丙二醇浓度为15%(w／w)。作为理想的杀微生物剂,另一个必要条件是对人体安全无毒。体外安全性实验表明2%TF凝胶剂无毒性和刺激性,不会导致细胞炎症或者阴道上皮细胞的超常增生,并且不能吸收入血产生系统副作用。以上结果提示TF是一个安全有效的抗HIV-1杀微生物剂候选分子,应进一步加大开发力度,早日进入临床开发和投放市场。