研究背景由于肿瘤细胞的表皮生长因子受体(epidermal growth factorreceptor，EGFR)及其下游信号传导途径通路调控失常，相当部分的肿瘤细胞存在EGFR的过度表达并与肿瘤细胞的恶性行为密切相关。肺癌是全球恶性肿瘤死亡的主要原因，现已成为对人类威胁最大的恶性肿瘤。约40％—85％非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者肺癌组织标本中可检测到EGFR表达或高表达，并且EGFR高表达和／或激活者病变进展较快，对化学治疗、放射治疗不敏感且预后差。由于60％—80％的肺癌患者在诊断时已属晚期，失去手术治疗的机会，治疗多采用以化疗为主的多学科综合治疗。但原发／继发耐药仍是肺癌化疗失败、化疗后复发的重要原因。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA(double strandRNA，dsRNA)介导，在mRNA水平上的序列特异性转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)过程，它能高效特异地抑制靶基因的表达。在我们实验室的前期工作中，已经利用化学合成的小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)分子筛选出了靶向EGFR基因的最佳RNAi作用位点，体外试验表明它能抑制肺腺癌细胞的生长，并由此构建了靶向EGFR基因的短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)表达载体。同时也发现，使用siRNA或shRNA下调肺腺癌细胞株SPC-A1的EGFR表达后，SPC-A1细胞对顺铂、阿霉素、泰素的敏感性增加约4—7倍，对放射治疗的敏感性也增加。在此基础上，本研究通过体外细胞培养的方法，观察靶向EGFR基因的shRNA表达载体对SPC-A1细胞存活率等的剂量效应和时间效应以及对EGFR基因表达调控的时间效应和剂量效应关系，并进一步研究EGFR基因表达下调后其下游的两条主要信号传导通路(Raf／MEK／ERK和PI3K／AKT通路)的变化和对三种在肿瘤多药耐药中起重要作用的基因(mdr1、lrp1和gst-π)的表达调控，以期从基因和蛋白水平上分析和探讨信号传导通路和相关耐药基因在shRNA下调SPC-A1细胞EGFR后所致化放疗增敏中可能的作用机制。第一章siRNA质粒抑制肺腺癌细胞株EGFR的表达及对细胞生物学行为的影响目的：探讨siRNA质粒介导的短发夹RNA(shRNA)表达载体对人肺腺癌细胞株SPC-A1中EGFR基因表达调控的时间效应和剂量效应关系，并观察此表达载体对SPC-A1细胞存活率等细胞生物学特征的影响的剂量效应和时间效应。方法：①抽提纯化质粒。②常规培养SPC-A1细胞，利用Lipofectamine 2000将pShEGFR载体和pShNEG载体转染入SPC-A细胞中。③用四氮唑蓝比色法(MTT法)检测不同剂量和时间时SPC-A1细胞的存活率。④用集落形成试验检测pShEGFR载体和pShNEG载体转染后SPC-A1细胞的集落形成能力。⑤用实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR)法检测pShEGFR载体和pShNEG载体转染SPC-A1细胞后EGFR基因mRNA表达水平的时间变化。⑥用免疫蛋白印迹试验(Western blot)检测pShEGFR载体和pShNEG载体转染SPC-A1细胞后EGFR蛋白水平的变化。结果：pShEGFR载体转染SPC-A1细胞后使其存活率和克隆形成率显著降低(分别降低达78.7％和68.8％)，和对照组相比差异均有显著性(P＜0.01)，并呈一定的剂量效应和时间效应。pShEGFR载体转染SPC-A1细胞后第2天EGFR mRNA水平降至最低，抑制率为84.3％(P＜0.01)，此后随时间推移稍有升高，但仍显著低于对照组水平(P＜0.01)；转染pShEGFR载体后第2天EGFR蛋白水平即有显著降低，至第6天降至最低，抑制率达82.6％(P＜0.01)，此后稍有回升，但仍显著低于对照组水平(P＜0.01)。结论：①siRNA质粒介导的shRNA表达载体能有效的从mRNA水平和蛋白水平下调肺腺癌细胞株SPC-A1的EGFR的表达，并呈一定的剂量和时间效应。②siRNA质粒介导的shRNA表达载体转染SPC-A1细胞能显著影响SPC-A1细胞的存活率和集落形成能力等肿瘤细胞生物学行为，有发展成为肿瘤基因治疗新方法的前景。第二章siRNA质粒抑制肺腺癌细胞株EGFR的表达对细胞内主要信号传导通路的影响目的：分析细胞外信号调节蛋白激酶1／2(extracellularsignal-regulated protein kinase，ERK1／2)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)和丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶(serine／threonine kinase，AKT)等在EGFR下游信号传导通路中起重要作用的节点蛋白在siRNA质粒抑制肺腺癌细胞株EGFR的表达后其基因mRNA水平、其总蛋白水平和磷酸化蛋白水平的变化，探讨其变化在SPC-A1细胞存活率降低、化放疗增敏中可能的机制。方法：①使用Lipofectamine 2000将pShEGFR和pShNEG载体转染至SPC-A1细胞。②实时定量PCR法检测未转染组、Lipofectamine 2000处理组、pShNEG转染组和pShEGFR转染组在转染后各时间点的erk1、erk2、pi3k和akt基因的mRNA表达水平。③免疫印迹试验检测未转染组、Lipofectamine 2000处理组、pShNEG转染组和pShEGFR转染组转染后各时间点的ERK1、ERK2、PI3K、AKT、p-ERK1、p-ERK2、p-PI3K和p-AKT蛋白的表达水平。结果：与未转染组相比，pShEGFR转染组在转染后第2、8、10天可见erk1基因mRNA表达量明显升高(P＜0.05)，在转染后第6、10天可见akt基因mRNA表达量明显升高(P＜0.05)，erk2和pi3k基因mRNA表达量无显著变化(P＞0.05)。与未转染组相比，ERK1、ERK2蛋白在pShNEG转染后第4天先明显降低，降低的幅度分别为39.3％、44.8％(P＜0.05)，第6天时回升至未转染组水平，第8、10天时明显升高，升高的幅度在30.7％—38.9％之间(P＜0.05)。转染pShEGFR组p-ERK1、p-ERK2蛋白表达量在转染当天即开始出现明显降低，降低的幅度分别为49.8％、38.5％(P＜0.05)，第2天时进一步降低，至第4—8天时显著降低，降幅在97.4％—98.3％之间(P＜0.01)，第10天时p-ERK1表达水平略有回升，p-ERK2较第4—6天时有升高趋势，但较未转染组仍显著为低(P＜0.05)。与未转染组相比，转染pShEGFR组PI3K蛋白表达量在转染第4、6天时明显降低，降低幅度为37.9％、41.2％(P＜0.05)，其他时间点与未转染组无显著差异(P＞0.05)；转染pShEGFR组AKT蛋白表达量在转染第8天时明显降低，降低幅度为32.4％(P＜0.05)，其他时间点与未转染组无显著差异(P＞0.05)；与未转染组相比，转染pShEGFR组p-PI3K蛋白表达量在转染第6天时即出现显著降低，幅度为29.4％(P＜0.05)，第8、10天时继续降低，降幅分别为43.7％和58.3％(P＜0.05)。转染pShEGFR组p-AKT蛋白表达量在转染第6天时显著降低，降幅为61.2％(P＜0.05)，第8、10天时继续降低，降幅分别为72.8％和85.6％(P＜0.05)。pShNEG转染组上述各基因mRNA和蛋白变化均无统计学意义(P＞0.05)。结论：①pShEGFR转染SPC-A1细胞后erk1基因和akt基因mRNA水平发生了显著变化，ERK1／2、PI3K、AKT蛋白表达水平也发生了显著变化。②pShEGFR转染SPC-A1细胞后p-ERK1／2、p-PI3K、p-AKT等磷酸化蛋白的表达水平也发生了显著变化，但变化趋势与基因水平和总蛋白水平并不一致。第三章siRNA质粒抑制肺腺癌细胞株EGFR的表达对主要耐药基因的影响目的：研究mdr1、lrp1和gst-π这三种在肿瘤细胞多药耐药中起重要作用的基因mRNA水平表达水平在siRNA质粒抑制肺腺癌细胞株EGFR表达后的变化，并探讨其变化在pShEGFR对SPC-A1细胞化疗增敏中可能的作用与意义。方法：①使用Lipofectamine 2000将pShEGFR和pShNEG载体转染至SPC-A1细胞。②实时定量PCR法检测未转染组、Lipofectamine 2000处理组、pShNEG转染组和pShEGFR转染组在转染后各时间点的mdr1、lrp1和gst-π基因的mRNA表达水平。结果：与未转染组SPC-A1细胞mdr1 mRNA表达量(0.000191±0.00003)相比，转染pShEGFR组在转染后2d mdr1mRNA表达量(0.0000833±0.000014)显著降低，抑制率达56.4％(P＜0.05)，转染后第4、6天继续降低，降幅为78.1％和84.9％(P＜0.01)，至转染后第8、10天mdr1 mRNA表达量稍有回升，但仍明显低于未转染SPC-A1细胞，降幅为71.5％和76.2％(P＜0.01)。与未转染组SPC-A1细胞lrp1 mRNA表达量(0.171±0.033)相比，转染pShEGFR组在转染后第2天lrp1 mRNA表达量(0.088±0.024)显著降低，抑制率达48.5％(P＜0.05)，转染后第4、6天继续降低，降幅为68.3％和77.7％(P＜0.01)，至转染后第8、10天lrp1 mRNA表达量较第4、6天稍有回升，但仍明显低于未转染SPC-A1细胞，降幅为73.1％(P＜0.01)和41.8％(P＜0.05)。gst-πmRNA表达量在pShEGFR转染前后差异无显著性(P＞0.05)。pShNEG转染组上述各基因mRNA表达水平变化均无统计学意义(P＞0.05)。结论：①pShEGFR转染SPC-A1细胞后，mdr1基因和lrp1基因mRNA表达水平均发生了显著变化，其变化的原因可能与其上游信号传导通路蛋白的表达水平变化有关。②mdr1基因和lrp1基因mRNA表达水平的变化可能是pShEGFR转染SPC-A1细胞所致化疗增敏效应的主要分子机制。