论文部分内容阅读
目的：监测黑色素瘤荷瘤小鼠脾脏T细胞亚群随时间的数量变化，可为评估临床肿瘤患者的免疫状态、判断肿瘤复发、病人预后、以及临床疗效提供依据，评估预后有重要的临床意义。方法：从120只条件均等的健康小鼠中选出6只正常小鼠作为基础值测定，其余114只小鼠随机平分为2组，荷瘤组（A组，57只）和空白（PBS）组（B组，57只）。于发现出瘤当天（D0），从A组随机选取5只测量并绘制肿瘤生长曲线。对于A组剩余小鼠和B组小鼠，自D0当日（含D0）开始，每隔5天各随机选出6只小鼠处死、取脾，制备单细胞悬液，行流式细胞（FACS）检测，确定CD3+T、CD4+T、CD8+T、初始T细胞在脾淋巴细胞悬液中所占比例，及CD4+T/CD8+T比值，直至荷瘤曲线观测组小鼠或A组剩余小鼠中出现半数以上死亡时结束观察。结果：1CD+3T淋巴细胞所占比例的动态变化：①空白组与荷瘤组相比，在D0（U=4.500P<0.05）、D5（U=0.000P<0.05）、D10（U=0.000P<0.05）、D15（U=0.000P<0.05）、D20（U=0.000P<0.05）、D25（U=0.000P<0.05）之间均存在统计学差异，表明CD+3T的数量随荷瘤天数的延长，空白组明显高于荷瘤组；②空白组内，正常小鼠、D0、D5、D10、D15、D20、D25之间有统计学差异（F=4.960P=0.001），其中正常小鼠、D0、D5、D10、D15分别与D20、D25有统计学差异（P<0.05），正常、D0、D5、D10、D15相互之间，D20与D25之间差异均无统计意义（P>0.05），表现CD+3T淋巴细胞的数量在D0和D15之间基本不变，为64.7，D15之后CD+3T淋巴细胞的数量随时间呈下降趋势，以17.6%的下降率降为D25时的53.4。③荷瘤组内，正常小鼠、D0、D5、D10、D15、D20、D25相互之间有统计学差异（F=3397.196P<0.05），其中任何两者之间均有差异（P<0.05），表现CD+3T淋巴细胞数量随时间呈下降趋势，由D0时的61.6，降为D25时的7.9，下降率为87.2%。2CD+4T淋巴细胞所占比例的动态变化：①空白组与荷瘤组相比，于D0时无统计学差异（t=-0.036P=0.972），D5、D10、D15、D20、D25均有统计学差异（t=-14.933P<0.05、U=0.000P<0.05、t=-37.860P<0.05、U=0.000P<0.05、U=0.000P<0.05），表明CD+4T的数量随时间延长，空白组明显高于荷瘤组；②空白组中，正常小鼠、D0、D5、D10、D15、D20、D25之间有统计学差异（F=3397.196P<0.05），其中正常小鼠、D0、D5、D10、D15与D20、D25分别相比，均有统计学差异存在（P<0.05），D20、D25之间有统计学差异（P<0.05），正常、D0、D5、D10、D15之间差异均无统计意义（P>0.05），提示CD+4T淋巴细胞数量在D0和D15之间基本不变，为38.7，D15之后才以27.9%的下降率降为D25时的27.9；③荷瘤组中，正常小鼠、D0、D5、D10、D15、D20、D25之间有统计学差异（F=160.370P<0.05），其中正常小鼠、D0分别与D5、D10、D15、D20、D25相比均有统计学差异（P<0.05），正常小鼠与D0之间差异无统计学意义（P>0.05），提示CD+4T淋巴细胞数量在D0之后出现下降趋势，由D0时的38.9降为D25时的3.1，下降率为92.0%。3CD+8T淋巴细胞所占比例的动态变化：①空白组与荷瘤组相比，于D0时无统计学差异（t=0.645P=0.533），D5、D10、D15、D20、D25差异显著（U=3.000P<0.05、U=0.000P<0.05、t=-8.131P<0.05、t=-16.059P<0.05、U=3.000P<0.05），表明CD+8T淋巴细胞的数量随时间延长，空白组明显高于荷瘤组；②空白组中，不同时间的CD+8T的数量差异无统计意义（F=0.434P=0.851），表明随时间延长，趋势比较平稳，CD+8T淋巴细胞的数量由D0时的21.6降为D25时的20.5，下降率仅为5.1%。③荷瘤组中，正常小鼠、D0、D5、D10、D15、D20、D25有统计学差异（F=76.815P<0.05），其中正常小鼠、D0分别与D5、D10、D15、D20、D25相比，有统计学差异（P<0.05），D5、D10分别与D15、D20、D25相比，有统计学差异（P<0.05）；正常、D0二者之间、D5、D10二者之间、D15、D20、D25相互之间无统计学差异（P>0.05），表明CD+8T淋巴细胞的数量随时间延长，呈下降趋势，且D25时为最低值，由D0时的22.2降为D25时的5.2，下降率为76.6%。4CD+4T/CD+8T比值的变化：①空白组与荷瘤组相比，于D0时无统计学差异（U=12.500P=0.363），D5、D10、D15、D20、D25差异显著（U=0.000P<0.05、t=-16.971P<0.05、t=-16.483P<0.05、t=-12.562P<0.05、U=0.000P<0.05），说明随着时间的延长，空白组CD+4T/CD+8T比值明显高于荷瘤组；②空白组中，正常小鼠、D0、D5、D10、D15、D20、D25有统计学差异（F=7.128P<0.05），其中正常小鼠、D0、D5、D10、D15之间分别与D20、D25相比有统计学差异（P<0.05），D20、D25相比有统计学差异（P<0.05），正常、D0、D5、D10、D15之间差异均无统计意义（P>0.05），说明CD+4T/CD+8T比值在D0到D15的范围内，保持1.8不变，从D15以后，该值以22.2%的下降率降为D25时的1.4；③荷瘤组中，正常小鼠、D0、D5、D10、D15、D20、D25总的来说有统计学差异（F=97.348P<0.05），其中正常、D0分别与D5、D10、D15、D20、D25之间有统计学差异（P<0.05），正常小鼠与D0无显著性差异（P>0.05），D5、D10、D15、D20、D25之间差异不明显（P>0.05），提示该比值逐渐下降，甚至倒置，从D0时的1.8降为D25时的0.6。5初始T细胞所占比例动态变化：①空白组与荷瘤组相比，于D0时无统计学差异（t=-0.200P=0.846），D5、D10、D15、D20、D25差异显著（U=0.000P<0.05、U=0.000P<0.05、t=-18.543P<0.05、U=0.000P<0.05、U=0.000P<0.05），可以认为，初始T淋巴细胞的数量随时间逐渐延长，空白组明显高于荷瘤组；②空白组中，正常小鼠、D0、D5、D10、D15、D20、D25之间存在差异（F=8.865P<0.05），其中正常、D0、D5、D10、D15分别与D20、D25相比有统计学差异（P<0.05），D20与D25相比有统计学差异（P<0.05），正常、D0、D5、D10、D15之间差异不显著（P>0.05），说明初始T细胞的数量在D0和D15之间，由34.1下降到32.2，下降率仅为5.4%；该比例在D15至D25之间，由32.2减少为21.7，下降率为32.6%；③荷瘤组中，正常、D0、D5、D10、D15、D20、D25有统计学差异（F=178.995P<0.05），其中任何两者之间均有差异（P<0.05），提示初始T淋巴细胞数量随时间呈下降趋势，从D0时的34.1降为D25时的2.5，下降率为92.7%。结论：1荷瘤组小鼠，随时间推移(D+0到D25)，其脾脏中CD3T、CD+4T、CD+8T占脾淋巴细胞悬液百分率都呈下降趋势，且三者的下降幅度（下降率）排序为：CD+++4T淋巴细胞>CD3T淋巴细胞>CD8T淋巴细胞；CD+4T/CD+8T下降趋势明显，表明黑色素肿瘤逐渐生长，小鼠的免疫功能逐渐下降；同时，初始T细胞比例也大幅下降。2空白组小鼠，随时间推移(D0到D25)，CD+3T淋巴细胞、CD+4T淋巴细胞、CD+8T淋巴细胞占脾淋巴细胞悬液百分率都呈现先保持相对稳定后逐渐下降的趋势，D15为这些比例由稳定跨向下降的转折时间点，三者后期(D15以后)的下降幅度（下降率）排序为：CD++4T淋巴细胞>CD3T淋巴细胞>CD+8T淋巴细胞；CD4+T/CD+8T先保持相对稳定，D15后呈现明显的下降趋势；同时，初始T细胞比例也呈现先保持相对稳定，D15后才大幅下降的趋势。3荷瘤组与空白组小鼠相比，二者的CD3+T、CD4+T、CD8+T、初始T细胞在脾淋巴细胞悬液中所占比例，及CD4+T/CD8+T比值均随时间的增加而逐渐下降，但下降幅度空白组小于荷瘤组，这表明，荷瘤组和空白组小鼠的免疫功能都随着年龄增长而下降，但荷瘤组的免疫功能下降地更快。4流式细胞技术（FACS）能够准确检测外周血T淋巴细胞亚群变化，为临床过继免疫治疗肿瘤提供个体化指导，可广泛用于临床。