金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为常见食源性致病菌,在自然界中广泛存在,其易污染肉制品、蔬菜等食品。由于缺乏有效、快速和可视化的检测方法,金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件时有发生。故亟需建立一种快速、灵敏可大批量应用的检测方法。本课题旨在通过噬菌体受体结合蛋白、免疫磁分离技术、RPA等温扩增与Cas12a切割显色体系,建立一种金黄色葡萄球菌快速可视化检测方法,并对所建立的检测方法进行食品应用,为金黄色葡萄球菌的检测提供新的技术方案。1、金黄色葡萄球菌噬菌体80α受体结合蛋白的表达与纯化通过NCBI数据库和文献查询获取噬菌体80αRBP与假定的结合功能区域pltaform序列,利用分子克隆技术将噬菌体80α受体结合蛋白RBP、pltaform克隆于p ET28a-EGFP载体中,再采用大肠杆菌表达系统,镍柱纯化重组蛋白的方式最终纯化得到EGFP、EGFP-RBP、EGFP-pltaform蛋白,为后续将EGFP-RBP、EGFP-pltaform作为检测的识别试剂及信号探针提供了关键的实验材料。2、金黄色葡萄球菌噬菌体受体结合蛋白的功能研究采用荧光显微镜,流式细胞仪、western的方法探索EGFP-RBP、EGFP与EGFP-pltaform蛋白对金黄色葡萄球菌的结合特性,并探索了温度、p H、Na Cl浓度对蛋白与金黄色葡萄球菌结合的影响。研究结果显示,仅仅只有EGFP-RBP蛋白表现出与金黄色葡萄球菌结合特性,结合最佳条件为:4℃、PH 5、50 m M Na Cl。3、免疫磁珠的制备利用磁珠上的亲和配体Ni离子可以与蛋白上的N端6×Histag标签进行结合的特性,将前期所制备的EGFP-RBP蛋白进行免疫磁珠的制备,进而对基质中的金黄色葡萄球菌进行捕获和浓缩。由于磁珠的数量、蛋白的浓度对于磁珠捕获金黄色葡萄球菌的效率有着较大的影响,因此,我们分别对两者进行了优化。结果显示,在磁珠数量为1.2×10~5个与蛋白浓度为60 ng时,磁珠能达到较好的捕获效率。4、可视化金黄色葡萄球菌检测方法的建立采用上述所制备的免疫磁珠对待测样品中的金黄色葡萄球菌进行快速捕获与富集分离后,使用水煮法提取金黄色葡萄球菌基因组DNA,之后将其作为模板进行RPA反应与Cas12a切割荧光反应,在紫外光照射进行肉眼观察,实现待测样品中金黄色葡萄球菌可视化的快速检测。为达到最佳检测效果,对切割反应体系进行了优化,我们发现增强ss DNA-FQ reporter的浓度可极大增强所观察的荧光强度,反应体系最终确定为250 n M Cas12a蛋白、500 n M cr RNA-1、2μL10×NEB buffer2.1、3μL RPA产物、2.5μM ss DNA-FQ reporter于20μL体系37℃中进行切割实验。将可视化检测应用于被金黄色葡萄球菌污染的牛奶中,最低检测限低至1×10~1 CFU/m L。