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目的:本研究旨在探讨NF-κB对急性心肌梗死后缺血性心力衰竭作用的影响,研究老龄心肌在急性心肌梗死期和慢性心力衰竭形成过程中的分子机制;通过研究使用巨细胞病毒(CMV)启动子重组单链AAV9(ssAAV9)载体和双链AAV9(dsAAV9)的组织表达特异性,筛选获得较好的可用于心脏疾病基因治疗的AAV9载体;并使用携带IκBα(inhibitor ofκBα,IKBα)基因的重组AAV9载体,靶向转导老龄小鼠心脏,探讨外源导入IKBα能否作为基因治疗药物,具有靶向抑制NF-κB通路,减少心肌梗死、抑制心肌细胞凋亡和防治老龄心肌缺血心力衰竭的作用及机制。本研究包括:(1)应用小鼠急性心肌梗死模型,研究缺血后老龄小鼠心肌急性期和慢性心力衰竭期NF-κB信号通路表达的差异,阐明缺血后心肌不同时期NF-κB参与的分子机制。(2)通过体外转导实验,对比研究杆状病毒载体系统包装制备的CMV启动子在重组ssAAV9和dsAAV9载体介导GFP基因在小鼠体内的组织表达特异性及表达时间点,筛选更适宜用于心脏疾病基因治疗的重组AAV9载体。(3)靶向转导IKBα基因至老龄小鼠心肌,通过在体心肌梗死模型和缺血性心力衰竭模型,探讨IKBα基因过表达减轻老龄心肌缺血损伤的作用机制。方法:第一部分:选取15~18月龄的近交系雄性C57BL/6J小鼠,开胸结扎左冠状动脉,建立小鼠急性心肌梗塞模型,随机分为假手术组(sham operation,SH)20只,心梗组(myocardial infarction,MI)70只,观测指标为小鼠心脏破裂发生、心肌梗死面积、左心室重构情况、心电图改变、心肌细胞凋亡、IKBα、p65、p50、IL-6、IL-10、MMP-2、MMP-9和TIMP的表达。第二部分:将剂量为1×1011vg的ssAAV9-CMV-eGFP及dsAAV9-CMV-eGFP载体分别经尾静脉注射导入C57BL/6J小鼠体内,于病毒载体转导0周、1周、2周、3周、4周、5周和8周,利用激光共聚焦和Western Blot检测心、肝、脾、肺、肾及脑中GFP蛋白表达,研究AAV9病毒颗粒的体内分布与存在时间,系统评价CMV启动子重组ssAAV9和dsAAV9载体的组织靶向性。第三部分:选取15~18月老龄雄性C57BL/6J小鼠,分别经尾静脉注射生理盐水,ssAAV9-CMV-eGFP和dsAAV9-CMV-IKBα,5周后采用Western Blot法检测心肌中IKBα、p65、p50的表达;并于病毒转染5周后,采用小鼠结扎冠状动脉建立心肌梗死模型,建模处理同第一部分;心梗模型建立后分别观察3天和28天,观察指标为生存情况、心肌梗死面积、细胞凋亡,心肌酶CK、LDH水平,肝酶ALT、AST水平,肾功Cre、Bun水平,Bcl-2、Bax的表达。结果:第一部分:(1)与假手术组相比,MI组出现明显的左室扩张和心功能障碍,心梗3天时出现明显的梗死区变薄扩张和收缩功能障碍,表现为LVEDd、LVESd、EXLVDd明显增加,Pws、Pwd和FS值明显降低(P<0.05)。(2)心梗后不同时间,免疫组化显示老龄组p65、P50阳性细胞数较假手术组高,差异有统计学意义(p65 400 vs154,p50 179 vs 83,P<0.05);WestemBlot检测发现心梗3天,28天时老龄组p65蛋白表达均高于假手术组,说明老龄小鼠心梗后NF-κB活性较假手术组高。第二部分:(1)激光共聚焦和Western Blot检测发现CMV重组ssAAV9和dsAAV9载体转导5周时,GFP蛋白主要在心肌和肝脏中表达,脾、肺、肾及脑中几乎未见表达。(2)各检测时间点dsAAV9载体所介导的GFP蛋白在心肌中的表达显著高于ssAAV9所介导的GFP表达。AAV9载体转导1周后在心肌和肝脏中开始表达GFP蛋白,随着时间的延长表达逐渐增强,转导第5周到达高峰,其在心脏转染效率(84.0±3.2%vs 73.6±3.4%,P<0.01),在肝脏转染效率(23.0±4.2%vs 17.6±3.4%,P<0.01);第8周时心脏转染效率为(75.0±3.5%vs 70.2±0.3%,P<0.01),在肝脏转染效率(20.0±3.2%vs 15.6±3.4%,P<0.01),表明dsAAV9-CMV-eGFP载体对心肌有更强的靶向亲和力,可在心肌中长期稳定的高效表达,但CMV启动子活性在肝脏中容易被沉默。第三部分:(1)IKBα基因转导可抑制老龄心肌NF-κB信号通路,与空病毒组相比,IKBα、p65、p50的表达在胞浆内显著增加(P<0.01),而在胞核内p65、p50的表达显著降低(P<0.01)。(2)在动物整体水平上,IKBα基因过表达有效保护老龄缺血性心力衰竭。空病毒组、IKBα基因转导组心肌梗死面积分别为40.0±7.7%vs34.0±8.0%,心肌细胞凋亡率分别为15.3±2.1%vs 5.1±1.3%,心梗面积及细胞凋亡率与空病毒组相比差异均有统计学意义(P<0.01),表明NF-κB信号通路抑制后有效保护老龄缺血心肌。NF-κB基因过表达可有效降低老龄心肌梗死面积和心肌细胞凋亡率,并改善生存率。老龄心肌梗死28天后,空病毒组及IKBα组的心梗面积分别为41.4±6.0%vs 35.5±4.7%;心肌细胞凋亡率分别为15.4±2.0%vs 5.5±2.3%,与空病毒组相比P<0.01;凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax显著增加,与空病毒相比(P<0.01)。(4)IKBα组的心肌酶CK、CK-MB和LDH亦显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:(1)NF-κB信号通路是参与急性心肌梗死后缺血性心力衰竭心肌损伤作用关键靶点。急性缺血早期通过激活NF-κB信号通路引起心肌损伤;心肌慢性缺血性心力衰竭过程中,NF-κB持续激活,在心力衰竭的进展中起关键作用;(2)CMV启动子的重组dsAAV9载体可在心肌中长期稳定的高效率表达,但在肝脏中CMV启动子活性很容易被沉默,AAV9-CMV载体是一种较为理想的心脏疾病基因治疗载体;(3)靶向抑制心肌NF-κB信号通路激发心肌内源性抗损伤能力是防治老龄心肌缺血性心力衰竭的关键环节,IKBα基因可以作为小分子基因治疗药物,具有靶向抑制NF-κB信号通路,减少心肌梗死、抑制心肌细胞凋亡,防治老龄缺血性心力衰竭的效果和作用,从而有效保护老龄心肌缺血损伤。