植酸酶(Phytases,Myo-inositol hexakis phosphohydrolase),作为一种磷酸水解酶类,在一定程度上可以水解植酸类化合物,释放出其所蕴含的无机磷酸基团、氨基酸以及蛋白质等营养物质,被广泛应用于饲料行业。在饲料中添加植酸酶可在一定程度上缓解单胃动物以及家禽对无机磷摄入需求压力,减少在饲料中人工添加无机磷。另外植酸酶可以提高饲料中以植酸形式存在的磷元素利用率,使单胃动物与家禽的粪便中磷元素排出量减少,进而缓解动物粪便造成的环境污染问题。植酸酶虽然作为潜力巨大的饲用类酶制剂,但在饲料颗粒化的过程中要经过90℃左右的高温压制,而植酸酶在高温条件下易失去活性,在一定程度上限制了其功能发挥。因此,提高植酸酶的热稳定性已成为当前工业生物需要解决的问题之一。蛋白质分子的半理性设计是目前较常用来修饰或改造酶分子的方法。半理性设计方法是根据蛋白质的空间结构或功能,设计可能含有正向突变的突变库,在突变库中进行筛选与验证。本研究中对大肠杆菌(Escherichia coli)来源的组氨酸家族3-磷酸植酸酶基因phyE(GenBank:DQ513832)进行半理性设计来提高其热稳定性。首先通过对组氨酸磷酸酶家族同源性的系统比对与挖掘,选取与我们的原始植酸酶基因有95%、96%同源性的1DKL和1DKQ作为蛋白质模型计算各个氨基酸的温度因子(B-factor或B-value)。B-factor表示了蛋白质分子中每个原子在其测定位置周围的不确定度,B-factor越大,相对应的原子越不稳定。最终挑选出13个氨基酸分别采取编码基因体外饱和突变构建6个突变文库。再建立96孔板筛选体系对每个突变文库进行筛选,得到了热稳定性较好的单突变菌株命名为BLP15。进一步依次引进不同的突变位点,最终获得了一株突变10个氨基酸的植酸酶突变体BLP56214,90℃热处理5 min后相对剩余酶活提高55%。随后将此突变体整合于毕赤酵母(Pichia pastoris)中进行异源表达,对发酵后产物进行植酸酶热稳定测定、Western Blot分析验证,实现了耐热突变体的异源表达。90℃热处理5 min后,重组植酸酶相对剩余酶活提高了32.7%。综上在本研究中,利用半理性设计与迭代突变的方法,我们获得了在毕赤酵母中热稳定性较好的突变菌株ZLA365。因此本实验在一定程度上为后续进一步提升植酸酶的热稳定性及酶活提供了良好的研究基础。