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1962年在日本伊娜首次发现家蚕二分浓核病毒（Bombyx mori bidensovirus，BmBDV），当时将其命名为空头性软化病病毒，该病毒特异感染家蚕中肠柱状细胞，在发病后期也可感染中肠杯状细胞，致使家蚕罹患浓核症，患病家蚕表现出下痢和空头等症状。该病毒粒子外围无囊膜包被，直径约20-24 nm，呈正二十面体结构，含有两套基因组DNA(VD1和VD2)，分别包装在各自病毒衣壳中，且病毒编码自身DNA聚合酶。2012年，将该病毒正式改名为家蚕二分浓核病毒。 BmBDV VD1-ORF2编码一个非结构蛋白NS1，该蛋白由361个氨基酸残基组成，其理论分子量大小为36 kDa，等电点为8.70。本课题组前期研究证实NS1蛋白为一个多功能蛋白，具有ATPase、解旋酶以及绑定特定DNA序列的活性，在BmBDV的生活史中起着重要的作用。多序列比对结果表明，BmBDV NS1蛋白与细小病毒NS1蛋白同源，细小病毒NS1蛋白为多功能蛋白，其活性由磷酸化调控，参与细小病毒基因组复制和转录的调控。在本研究中，利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达并纯化BmBDV NS1蛋白，通过质谱鉴定该蛋白的磷酸化修饰位点;另外，定点突变磷酸化位点后，表达、纯化三个突变型BmBDVNS1蛋白，测定其ATPase活性，将其与野生型NS1蛋白活性进行比较，从而鉴定磷酸化修饰对BmBDV NS1蛋白活性的影响。 本文利用杆状病毒表达载体系统在Sf-9细胞中表达NS1蛋白，对Sf-9细胞中表达的NS1蛋白进行鉴定，将NS1蛋白条带抠出，并通过LC-MS/MS对其进行二级质谱分析，质谱结果表明NS1蛋白为磷酸化蛋白，其磷酸化修饰位点为BmBDV NS1序列中184位点的Thr残基，而Thr-181和Thr-191为潜在的磷酸化修饰位点。为此，本文设计3对突变引物，将其三个苏氨酸残基所对应的碱基:541-543，550-552，571-573 ACT突变为GGT，测序分析成功构建三个突变型ns1序列，将突变型和野生型ns1序列转座至Ac-Bacmid上，构建重组Ac-Bacmid，通过转染Sf-9细胞获得重组病毒，将重组病毒感染Sf-9悬浮细胞，在摇瓶中悬浮表达野生型和三个突变型NS1蛋白，收集感染后的悬浮细胞，对其进行超声破碎，利用镍柱纯化出野生型NS1蛋白和NS1蛋白突变体。经SDS-PAGE和Westem blot对纯化的靶蛋白进行验证后，利用ATP酶活性连续反应光谱法定量检测试剂盒测定纯化后的NS1蛋白ATPase活性，其活性结果为:Thr184位点突变后，NS1-M2的ATPase活性与wt-NS1活性相比，差异极显著;Thr-191突变后，NS1-M3的的ATPase活性与wt-NS1活性相比，差异显著;Thr-181突变后，NS1-M1的活性虽下降，与野生型NS1活性相比，没有明显差异;对野生型NS1蛋白进行磷酸酶处理，使NS1去磷酸化，去磷酸化后的NS1蛋白活性也显著低于野生型NS1活性。活性结果表明NS1蛋白序列中184位苏氨酸残基存在磷酸化修饰，磷酸化修饰能显著改变NS1蛋白的ATPase活性，BmBDV NS1蛋白与病毒DNA复制、基因转录和病毒增殖等生化过程相关，进而为了解该病毒增殖的分子机制和病毒防控提供了理论基础。 家蚕核型多角体病毒上几丁质酶基因（chiA）和半胱氨酸蛋白酶基因（cp）的编码产物与宿主死亡后液化相关，为病毒增殖非必需基因，敲除后可延长病毒对家蚕的半数致死时间(Median lethal time，LT50)，从而延长外源蛋白的表达时间。在本研究中，以缺失几丁质酶基因和半胱氨酸蛋白酶基因的家蚕核型多角体病毒(△Bm-Bacmid)为载体，在家蚕体内表达野生型和突变型BmBDV NS1蛋白，统计每天家蚕死亡头数，测定各病毒对家蚕的半数致死时间，通过比较各半数致死时间的大小，从而判断BmBDVNS1蛋白的磷酸化修饰作用对NS1蛋白毒力强弱的影响。统计结果如下:表达wt-NS1病毒的LT50比空△Bm-Bacmid的LT50短27.36 h;表达NS1-M1的病毒LT50比表达wt-NS1的病毒长15.36 h;表达NS1-M2的病毒LT50比表达wt-NS1的病毒长21.84 h;表达NS1-M3的病毒LT50比表达wt-NS1的病毒长15.36 h。实验数据表明NS1蛋白对家蚕确实具有毒理作用，磷酸化修饰能增强NS1蛋白的毒力，其作用机制有待于进一步研究。