论文部分内容阅读
近几十年来,益生菌已广泛应用于水产养殖中,并已证明能有效减少和消除细菌感染。本文将利用益生菌在模式生物斑马鱼体内进行水产病原细菌感染后的拮抗保护效果研究,以期为在水产领域有效利用益生菌进行疾病防控,达到绿色生态养殖的目标,提供安全健康的水产品,满足人民群众不断增长的消费需求。嗜水气单胞菌和副溶血弧菌分别是淡水和海水来源的重要的人兽鱼共患性疾病的病原体,是多种鱼类和动物的细菌性疾病的主要原因,也经常引起人类的食物中毒及腹泻甚至败血症,造成非常严重的公共卫生问题。由于这2种细菌感染的宿主多样,致病过程及机制复杂,有必要进行详细的研究。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）和红色荧光蛋白（red fluorescent protein,RFP）是广泛使用的标记细菌或其他病原体的分子标记物。在本研究中,旨在构建GFP标记的嗜水气单胞菌和RFP标记的副溶血性弧菌,以及益生菌短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）对嗜水气单胞菌的拮抗作用。以下为本文的主要研究结果。（1）利用化学方法对嗜水气单胞菌进行GFP标记。将含有GFP的pWSK129质粒利用化学法标记Ah1菌株,测试其质粒的稳定性、生长曲线及毒性。实验结果发现,成功标记了GFP的Ah1菌株,命名为Ah1GFP菌株,在荧光显微镜下呈现绿色荧光,凝胶电泳检测可以获得含GFP质粒的正确条带。质粒稳定性的检测结果表明,当Ah1GFP传递到第4d时,质粒的表达仍为100%,第5至第10d稳定性逐渐降低。与野生型菌株Ah1相比,标记菌株Ah 1GFP的生长曲线及毒性无差异。Ah1GFP和Ah1的生长曲线相似,2-8 h为对数增长期,8 h后进入稳定期。毒力也未发生明显改变,Ah1的LD50为7.52 x 10~6CFU/ml,Ah1GFP的LD50为3.47 x 10~7CFU/ml。这些都为之后用Ah1GFP进行示踪实验奠定了基础。（2）利用三亲本杂交的方法对副溶血性弧菌进行RFP标记。将含有RFP的p VSV209质粒利用三亲本杂交法标记Vp13菌株,并测试其质粒的稳定性、生长曲线及毒性。实验结果发现,成功标记了RFP的Vp13菌株,命名为Vp13RFP菌株,在荧光显微镜下呈现红色荧光,凝胶电泳检测可以获得含RFP质粒的正确条带,在LBS平板上长出肉眼可见的红色菌落。质粒的稳定性检测结果表明,在质粒表达前3d的稳定性为100%,之后至第10d稳定性逐渐降低,第10d稳定性为5%。Vp13RFP和Vp13的生长曲线相似,1-8 h之内为对数增长期,8 h后进入稳定期。毒力也未发生明显改变,Vp13的LD50为3.77 x 10~7CFU/ml,Vp13RFP的LD50为3.59 x 10~7CFU/ml。这些都为之后用Vp13RFP进行示踪实验奠定了基础。（3）益生菌短小芽孢杆菌对斑马鱼的毒性试验。为了在斑马鱼体内进行益生菌短小芽孢杆菌对荧光标记细菌的保护作用,首先测试益生菌本身对斑马鱼的毒性。通过浸泡感染法测定不同浓度(10~2、10~4、10~6、10~8、10~9、1010CFU/mL)的短小芽孢杆菌对3 dpf斑马鱼幼鱼的毒性,连续记录各组在4 d内每个时间点的死亡率。结果表明,在1010CFU/mL、10~9CFU/mL和10~8CFU/mL条件下,这3个高浓度的短小芽孢杆菌的死亡率分别为100%、85%和25%。所有斑马鱼在第3 d死亡。在10~2CFU/mL、10~4CFU/mL和10~6CFU/mL的低浓度下,短小芽孢杆菌的死亡率分别为10%、15%和15%。超过50%的斑马鱼在第3 d仍然存活。因此,我们决定在下一步使用这3个较低浓度的短小芽孢杆菌来测试其拮抗作用。（4）短小芽孢杆菌对Ah1GFP感染斑马鱼的保护作用。感染对象为3 dpf斑马鱼幼鱼,每组20尾。各组嗜水气单胞菌浓度为1.7×10~8CFU/mL,短孢子棒,每组使用三种不同浓度（10~210~410~6CFU/mL）。第一组用嗜水气单胞菌和短小双歧杆菌浸泡斑马鱼。在第二组中,斑马鱼被短小双歧杆菌浸泡12小时,然后感染嗜水气单胞菌。第三组用斑马鱼感染嗜水气单胞菌6小时,然后用短小双歧杆菌浸泡。结果表明,三组对短小双歧杆菌的最高保护率为10~6CFU/mL,死亡率均较低。在第一组中,10~2CFU/mL组的死亡率为35%,10~4CFU/mL组为30%,10~6CFU/mL组为5%;在第二组中,10~2CFU/mL组的死亡率为15%,10~4CFU/mL组的死亡率为10%,10~6CFU/mL组的死亡率为5%。在第三组中,12小时后,10~2CFU/mL组的死亡率为45%,10~4CFU/mL组的死亡率为30%,10~6CFU/mL组的死亡率为10%,每个时间段的死亡人数逐渐减少。综上所述,本文提供了一种有效的利用荧光蛋白标记致病性嗜水气单胞菌和副溶血性弧菌的方法。利用绿色荧光蛋白质粒pWSK129通过化学转化法成功标记了嗜水气单胞菌（Ah1菌株）。利用红色荧光蛋白质粒p VSV209通过和三亲杂交法成功标记了副溶血性弧菌（Vp13菌株）。最后,106 CFU/mL浓度范围内的短小芽孢杆菌对嗜水气单胞菌浸泡感染的斑马鱼幼鱼有保护作用。本研究为益生菌应用于水产细菌性疾病的防控提供了理论基础。