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胆固醇是昆虫细胞膜成分,同时,更主要的作用是作为蜕皮激素的前体。由于昆虫体内缺少2种关键性的合成酶,昆虫不能通过自身从头合成胆固醇。事实上,昆虫主要依赖食物中的胆固醇来满足生长,发育和繁殖的需要。中肠是吸收转化胆固醇的主要部位,然后通过血.淋巴中的脂蛋白,运送到前胸腺转化利用;或是运送到脂肪体以自由的胆固醇和胆固醇酯储存起来。因而,昆虫胆固醇代谢研究的重点集中在胆固醇代谢运输系统。 SCP2蛋白是动物中广泛存在的脂质转运蛋白。哺乳动物中SCPx/pro-SCP2基因是一个融合基因,其中SCP2蛋白的主要功能是参与胆固醇和脂肪酸的代谢,在细胞内运输胆固醇及脂类。SCP2能将细胞中的类固醇物质运载到线粒体,形成类固醇激素,如昆虫的蜕皮激素;吸收自由的胆固醇形成细胞膜等。 本研究首先对家蚕SCPx/SCP2基因进行生物信息学分析,预测了这个基因核酸、mRNA、和蛋白质情况;利用RT-PCR,克隆了这个基因并调查该基因在不同组织、不同时期的表达情况;最后,通过pET表达系统将家蚕SCPx蛋白和SCP2蛋白进行体外表达,为以后的功能研究奠定基础。 以棉铃虫SCPx基因为参照,经过生物信息学分析,在家蚕基因组中找到了家蚕的SCPx/SCP2基因组序列,长为8902bp。基于基因结构预测,推测家蚕SCPx/SCP2基因有2个编码区1个内含子。用DNAstar软件将EST进行拼接,结果得到2个contigs。将家蚕的BmSCPx/BmSCP2基因在cDNA水平进行克隆、测序和分析,得到了家蚕BmSCPx/SCP2的编码区完整的序列。通过分析发现,该基因存在两种拼接形式,即BmSCPx和BmSCP2两种的mRNA形式。其中,BmSCPx长2165nt,BmSCP2长1035nt。经过实验验证,发现BmSCPx/SCP2基因的确有选择性拼接形式的存在,其中BmSCP2这种形式缺少了编码硫解酶结构域的区段的序列。 BmSCPx蛋白由536个氨基酸组成,BmSCP2蛋白由146个氨基酸组成。在线工具预测,发现BrnSCPx蛋白包含硫解酶-N,硫解酶-C和SCP2结构域。BmSCP2蛋白只含有SCP2结构域。BmSCPx和BmSCP2蛋白质的分子量、等电点分别是57.8kD、16.2kD和6.54、9.22。使用BLAST软件分析发现,BmSCPx蛋白与棉铃虫SCPx蛋白有88%同源性和94%相似性。与果蝇SCPx蛋白有64%同源性和79%相似性。按蚊SCPx蛋白65%同源性和76%相似性。并且无论是BmSCPx蛋白,还是BmSCP2蛋白,在C端都有Ser-Lys-Leu结构过氧化酶体的靶序