【摘 要】
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目的:牙周炎是一种常见的慢性炎症性疾病,与牙周致病菌和宿主免疫细胞之间复杂的相互作用有关。P.gingivalis在牙周炎中被认为是重要的致病菌之一,可以与免疫细胞相互作用。巨噬细胞作为免疫细胞,具有重要的防御和调节功能,P.gingivalis刺激巨噬细胞极化为M1型后,M1型巨噬细胞能够识别并吞噬病原体,并有助于进行抗原呈递激活T细胞反应。研究表明M1型巨噬细胞分泌的外泌体可引起支持组织细胞的
【基金项目】
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国家自然科学基金（No.81970942）； 辽宁省教育厅基金（JC2019024）；
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目的:牙周炎是一种常见的慢性炎症性疾病,与牙周致病菌和宿主免疫细胞之间复杂的相互作用有关。P.gingivalis在牙周炎中被认为是重要的致病菌之一,可以与免疫细胞相互作用。巨噬细胞作为免疫细胞,具有重要的防御和调节功能,P.gingivalis刺激巨噬细胞极化为M1型后,M1型巨噬细胞能够识别并吞噬病原体,并有助于进行抗原呈递激活T细胞反应。研究表明M1型巨噬细胞分泌的外泌体可引起支持组织细胞的病理改变,然而巨噬细胞M1极化对其它相关免疫细胞的影响少有研究。RAW264.7细胞是小鼠单核细胞/巨噬细胞系,广泛用于评估体外单核细胞/巨噬细胞的功能。本实验利用P.gingivalis作用下巨噬细胞分泌的外泌体刺激RAW264.7细胞,观察该外泌体能否影响RAW264.7细胞的活力、凋亡以及细胞表面MHCⅡ表达的情况,探究巨噬细胞源性外泌体是否可对RAW264.7细胞造成影响。研究方法:培养U937细胞,经PMA刺激为M0型巨噬细胞。M0型巨噬细胞分为两组,一组加入P.gingivalis W83（MOI=100）刺激为M1型巨噬细胞,用流式细胞术鉴定M1型巨噬细胞;另一组加入等体积的培养液。分别收集两组细胞上清液,未加入P.gingivalis表示为EXO-N组,加入P.gingivalis表示为EXO-P组,超高速离心法提取外泌体,PBS重悬后收集备用。1.利用TEM,NTA,Western Blot鉴定外泌体。2.培养RAW264.7细胞,用外泌体EXO-N和EXO-P分别刺激RAW264.7细胞,实验分为空白对照组、EXO-N组、EXO-P组。用CCK-8法检测RAW264.7细胞活力;3.FITC-Annexin V/PI双染法检测RAW264.7细胞凋亡情况;Real-time PCR检测Caspase 3、Caspase 9、Bax和Bcl-2 m RNA的表达;Western Blot检测Caspase 3、Caspase 9、Bax和Bcl-2蛋白的表达。4.流式细胞术检测RAW264.7细胞表面MHCⅡ表达情况;Real-time PCR检测CⅡTA、HLA-DRA、HLA-DRB m RNA的表达。结果:1.流式细胞术鉴定P.gingivalis刺激M0型巨噬细胞后成功诱导为M1型巨噬细胞,M1型巨噬细胞表面表达标志物蛋白CD86。未加入P.gingivalis的EXO-N组和加入P.gingivalis的EXO-P组均提取出外泌体,两组外泌体鉴定结果无明显差异,TEM镜下可见两组外泌体均成类盘形囊泡状结构;NTA对外泌体进行粒径分析检测:EXO-N组平均粒径为114.1nm,EXO-P组平均粒径为122.4n m;Western Blot检测显示两组外泌体表面标志蛋白CD9、HSP70和TSG101均阳性表达。2.加入EXO-N和EXO-P与RAW264.7细胞培养24h后,倒置显微镜下观察到RAW264.7细胞伸出伪足,成功发生极化。CCK-8检测结果显示EXO-P组和EXO-N组OD值升高并具有统计学差异;EXO-P组OD值升高更为显著。3.P.gingivalis作用下巨噬细胞分泌的外泌体抑制RAW264.7细胞凋亡:流式细胞术检测结果显示EXO-P组和EXO-N组凋亡率降低;Real-time PCR检测结果显示EXO-P组和EXO-N组中,下调Caspase 3、Caspase 9、Bax m RNA的表达并上调Bcl-2 m RNA的表达,结果具有统计学差异,EXO-P组变化更为显著;Western Blot检测结果显示EXO-P组和EXO-N组中,Caspase 3、Caspase 9、Bax蛋白表达降低,Bcl-2蛋白表达升高,结果具有统计学差异,EXO-P组变化更为显著。4.P.gingivalis作用下巨噬细胞分泌的外泌体提高RAW264.7细胞表面MHCⅡ的表达:流式细胞术检测MHCⅡ表达结果显示EXO-P组和EXO-N组细胞表面MH CⅡ表达增加;Real-time PCR检测结果显示EXO-P组和EXO-N组,上调RAW264.7细胞中CⅡTA、HLA-DRA、HLA-DRB m RNA的表达,结果具有统计学差异;EXO-P组变化更为显著。结论:P.gingivalis作用下巨噬细胞分泌的外泌体可以增强RAW264.7细胞活力,抑制其凋亡,并提高RAW264.7细胞表面MHCⅡ的表达,从而增强细胞的抗原提呈功能。
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