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背景:RhoA-ROCK通路介导了神经细胞的许多生理和病理过程,如细胞的伸展、收缩和损伤后再生长相关过程均受到此通路的调节。有研究表明Rho A-ROCK通路的抑制,可促进神经细胞的生长,并且ROCK2起到了主导的作用。最新研究表明,H2S通过促进Rho A的磷酸化,对缺血性脑损伤起到了保护作用,但未明确H2S和ROCK2蛋白之间的具体机制。H2S能否对ROCK2的磷酸化修饰产生影响,以及此修饰对缺血性脑损伤是否起到保护作用,未见相关的报道。因此本课题进行体外磷酸化实验,观察H2S对ROCK2Tyr722磷酸化的影响,并深入研究ROCK2Tyr722磷酸化介导的H2S对神经细胞缺氧复氧损伤（H/R）的保护作用。目的:1.探索H2S对ROCK2的Tyr722位点磷酸化的调节作用2.探讨H2S对海马神经元细胞ROCK2Tyr722位点的作用及其潜在的H/R损伤保护机制;3.探讨H2S对海马神经元细胞BKCa通道电流的影响方法:1.构建ROCK2wild-p GEX-6p-1和ROCK2Y722F-p GEX-6p-1重组原核质粒,在大肠杆菌中诱导表达GST-ROCK2wild和GST-ROCK2Y722F蛋白,通过考马斯亮蓝染色法,观察GST-ROCK2wild和GST-ROCK2Y722F蛋白的表达情况。通过Western-Blot检测H2S对ROCK2Tyr722位点酪氨酸体外磷酸化的影响。2.培养和鉴定大鼠原代海马神经元细胞（RHNs）后,加入不同浓度的NaHS,通过Western-Blot检测NaHS对ROCK2Tyr722位点磷酸化的影响,酶联免疫实验（ELISA）法测定ROCK2活性。3.构建ROCK2Y722-p EGFP-N1和ROCK2Y722F-p EGFP-N1重组真核质粒,通过慢病毒的方式分别将empty plasmid、ROCK2Y722-p EGFP-N1和ROCK2Y722F-p EGFP-N1转染至RHNs中,通过倒置荧光显微镜检测转染效率。通过Western-Blot检测NaHS对细胞中ROCK2Tyr722位点磷酸化的影响。4.使用ELISA实验检测NaHS对ROCK2活性的作用。5.建立H/R损伤模型,使用细胞计数试剂盒（CCK-8）、乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒、神经特异性烯醇化酶（NSE）检测试剂盒和Ca2+成像系统荧光显微镜分别检测转染真核质粒加入NaHS后的细胞活力变化、LDH和NSE释放量的变化、Ca2+含量的变化来评估缺氧性损伤的保护作用。6.全细胞膜片钳记录NaHS对转染重组质粒后的RHNs大电导钙激活钾通道(BKCa)电流的影响。结果:1.考马斯亮蓝染色结果显示,在大肠杆菌菌液中成功表达出GST-ROCK2wild和GST-ROCK2Y722F蛋白。Western-Blot结果显示,NaHS显著促进了GST-ROCK2wild蛋白Tyr722位点的磷酸化,但是GST-ROCK2Y722F蛋白722位点并没有观察到磷酸化。2.NaHS呈浓度依赖性的显著抑制RHNs细胞中ROCK2蛋白的表达并促进ROCK2蛋白Tyr722位点的磷酸化。3.使用倒置荧光显微镜检测转染效率发现,转染72 h的效率最高。在空质粒转染的RHNs中,NaHS呈浓度依赖性的促进p-ROCK2Y722/ROCK2。在ROCK2Y722-p EGFP-N1转染的RHNs中,NaHS呈浓度依赖性的促进p-ROCK2Y722/ROCK2和GFP-p-ROCK2Y722/GFP-ROCK2Y722。在ROCK2Y722F-p EGFP-N1转染的RHNs中,NaHS呈浓度依赖性的促进p-ROCK2Y722/ROCK2。4.在空质粒转染的RHNs中,仅100、200μmol/L NaHS对ROCK2活性有显著抑制作用;在ROCK2Y722-p EGFP-N1转染的RHNs中,不同浓度NaHS明显抑制ROCK2活性;在ROCK2Y722F-p EGFP-N1转染的RHNs中,只有200μmol/L NaHS显著抑制ROCK2活性。5.CCK-8的实验结果显示,在转染真核质粒的RHNs中,H/R损伤模型显著降低了细胞活力。在空质粒转染的RHNs中,仅100、200μmol/L NaHS显著提升细胞活力;在ROCK2Y722-p EGFP-N1转染的RHNs中,不同浓度的NaHS均有显著提升细胞活力作用。在ROCK2Y722F-p EGFP-N1转染的RHNs中,仅200μmol/L NaHS有显著提升细胞活力作用。和转染空质粒以及ROCK2Y722F-p EGFP-N1的RHNs相比,100、200μmol/L NaHS对转染ROCK2Y722-p EGFP-N1转染的RHNs具有更加显著提升细胞活力的作用。LDH检测结果表明,在转染真核质粒的RHNs中,H/R损伤模型显著提升了细胞中LDH的释放量。在空质粒转染的RHNs中,仅100、200μmol/L NaHS显著降低LDH释放量;在ROCK2Y722-p EGFP-N1转染的RHNs中,不同浓度的NaHS均显著降低LDH释放量。在ROCK2Y722F-p EGFP-N1转染的RHNs中,仅100、200μmol/L NaHS显著降低LDH释放量。和转染空质粒以及ROCK2Y722F-p EGFP-N1的RHNs相比,100、200μmol/L NaHS对转染ROCK2Y722-p EGFP-N1转染的RHNs具有更加显著的抑制LDH释放的作用。NSE检测结果表明,在转染真核质粒的RHNs中,H/R损伤模型显著提升了细胞中NSE的释放量。在空质粒转染的RHNs中,仅200μmol/L NaHS显著降低NSE释放量;在ROCK2Y722-p EGFP-N1转染的RHNs中,不同浓度的NaHS均显著降低NSE释放量。在ROCK2Y722F-p EGFP-N1转染的RHNs中,仅100、200μmol/L NaHS显著降低NSE释放量。和转染空质粒以及ROCK2Y722F-p EGFP-N1的RHNs相比,100、200μmol/L NaHS对转染ROCK2Y722-p EGFP-N1的RHNs具有更加显著的抑制NSE释放的作用。钙成像结果显示,H/R损伤显著提升细胞内的Ca2+荧光强度,加入NaHS可以抑制Ca2+荧光强度。和转染空质粒以及ROCK2Y722F-p EGFP-N1的RHNs相比,NaHS对转染ROCK2Y722-p EGFP-N1的RHNs具有更加显著的抑制Ca2+荧光强度的作用。6.全细胞膜片钳结果显示,本次所记录的是BKCa电流。转染真核质粒的RHNs中加入NaHS后显著增加了BKCa电流。和转染空质粒以及ROCK2Y722F-p EGFP-N1的RHNs相比,NaHS对转染ROCK2Y722-p EGFP-N1的RHNs具有更加显著的增加BKCa电流的作用。结论:1.H2S可以促进ROCK2的Tyr722的磷酸化并抑制ROCK2的表达和活性。2.ROCK2Tyr722介导了H2S对大鼠海马神经元H/R损伤的保护作用。3.ROCK2Tyr722介导了H2S对大鼠海马神经元BKCa通道电流的影响。