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前言 尽管应用抗生素、血管活性剂以及抗细胞因子疗法,脓毒症、缺血-再灌注损伤及多器官功能障碍综合症仍是造成人类高死亡率、高患病率的重要原因。这些损害部分是由免疫系统对感染原、缺血或其他严重应激所产生的反应介导。解决这个问题的潜在途径是利用被称为“应激反应”的自身防御机制。“应激反应”的特征是一过性下调细胞非必需蛋白的合成及增加被称为热休克蛋白(HSPs)的内源性保护因子的合成。热休克蛋白(HSPs)作用是促使损伤导致变性的蛋白适当地再折叠。HSP家族中HSP70被认为在细胞保护中发挥重要作用。但是这种通过诱导热休克蛋白来改善人类疾病预后的方法,尚未被应用于临床。因为目前公认的诱导热休克蛋白产生的刺激因子如热应激(体温达42℃左右)、亚砷酸钠、内毒素等,或本身就具有毒性或机体不能耐受。因此,寻找一种无害的或机体能够耐受的诱导热休克蛋白的应激原引起了研究者的极大兴趣。 谷氨酰胺传统被认为是一种非必需氨基酸,现在认为在严重损伤或疾病时则是一种条件性重要的营养物质。在健康的机体里,谷氨酰胺是细胞浆和骨骼肌中最丰富的氨基酸。—但是在机体受到损伤、手术或感染后,循环和组织中的浓度则迅速下降。随着对疾病和动物的损伤模型的广泛研究,人们发现补充谷氨酰胺可以提高生存率、调整免疫功能。但是,谷氨酰胺在这些患者中发挥保护作用的机制仍不清楚。 新近的研究发现在离体试验中谷氨酰胺是一种有效的HSP70诱导剂,而且谷氨酰胺可能在调节炎症反应中也发挥作用。 因此,我们假设谷氨酰胺可能会增强LPS诱导的脓毒症大鼠模型多种组织的HSpoo表达、降低细胞因子的释放\减少终末器官的损害。 材料与方法 1.实验动物与分组 健康雄性清洁级Wistar大鼠18只(体重250-3009人随机分为3组,每组6只: 五)内毒素组(LPS): 大鼠禁食不禁水u /J’时,腹腔注射异戊巴比妥 66mg/kg麻醉大鼠,然后尾静脉注射 ms,剂量为 s m牙ig。随即尾静脉缓慢推注林格液25 nil/kg。 *)谷氨酸胺组(Gin人 在实验前将谷氨酸胺溶于生理盐水配成质量分数为3%的溶液。以上述方法给予LPS之后,立即将谷氨酸胺通过微量泵从尾静脉以 0.sndmin的速度滴人已麻醉的大鼠,剂量为 0.75g/kg。 (3)对照组(C): 进行上述尾静脉给液时,空白对照组均给予同等剂量的生理盐水。 2.观察指标 门)血浆肿瘤坏死因子一a(TNF一一:各组动物均在给予LPS(空白对照组在给予生理盐水)后oj广为小时,尾静脉采血,3000转/分离心取上清液,-20℃保存待测。采用放射免疫分析法测定,按试剂盒(解放军总医院提供)操作说明步骤进行。 闷)肺、肝、肠中 HSpoo的检测:上述各组分别于术后 6小时深麻处死,取肺、肝、肠组织进行检测。采用SABC方法行免疫组织化学染色,切片行微波抗原修复,一抗效价为1:100。DABO7℃,smin)显色,用蒸馏水洗净DAB后阴于,苏木素复染核,中性树胶封片镜检。胞内有棕黄色颗粒者为阳性细胞。每组各有一 ·2·张切片用磷酸盐缓冲液(PBS,PH 7.4)代替 HSP70单克隆抗体,做为免疫组化的阴性对照。应用 Metamorph/DP10/BX51显微图象分析系统测定灰度值:每组每只大鼠肺、肝、肠各组织均随机选取6个视野k00 X)计算灰度值。 门)肺、肝、肠的病理学观察:各组大鼠给药后6小时深麻处死,取肺、肝、肠组织。用体积分数为10%的甲醛固定,行石蜡包埋、切片人E染色,观察组织变化。 3.统计学处理 实验数据以均数。标准差ku)表示。采用S陀510.0统计分析软件包行单因素方差分析(ANOVA人两组间计量资料采用t检验。pJ.05表示有统计学意义。 实验结果 1.血浆TNF一。浓度 结果显示,在注射LPS后2小时人 组比LPS组血浆TNF-a水平显著降低h<0.005人而注射 LPS后 4在 /J’时,两组血浆TNF-a浓度没有明显差异h>0.05人 2.肺、肝、肠组织中HSpoo的测定 结果显示,Gin组肺、肝、肠组织的 HSpoo灰度值K9.71。9.M)、(89.38。12.03)、门07.61。N.02)均分别明显低于班组肺、肝、肠组织的 HSpoo 灰度值(107.94。10.96,p<0.05)、(120.0415.73,p<0.05)、(123.31 114.sl,p<0.05)。提示Gi组肺。肝、肠组织 HSpoo的含量高于 LPS组。 3.肺、肝、肠的病理学观察 结果显示,Gi组肺、肝、肠组织损伤程度比LPS组较轻。 讨 论 本研究的结果证实谷氨酸胺是一种有效的HSP表达增强剂。 ·3·与以前的热休克反应诱导剂不同的是,谷氨酚胺在诱导HSP表达时,对器官没有产生任何可以检测到的有害作用。而且,本研究显示,对内毒素损伤静脉给予单次剂量的谷氨酸胺可以显著地降低终末器官的病理损害。谷?