基因治疗是通过将特定基因导入到功能细胞,用来有针对性地治疗疾病的一种安全的方法。基因治疗的成功离不开基因递送系统,该系统能够将治疗基因有效导入特定细胞或组织。然而,探索研究更加安全和高效的基因载体是目前非病毒基因治疗在临床应用中的重大挑战。近年来,合成的非病毒载体由于其具有许多优良特性而被用作仿病毒类基因载体,现已在基因治疗方面受到广泛研究。尽管此类载体能够实现一定程度的基因表达,但仍存在高细胞毒性、低转染效率、低细胞识别和低摄取能力等问题,限制了其在基因治疗的临床应用。只有将这些问题解决,才能确保基因成功递送到特定细胞,并实现良好的基因表达。在非病毒基因载体中,阳离子聚合物基因载体由于合成简便、化学结构多样和结构修饰容易而成为研究热点。其中,聚乙烯亚胺（PEI）是最有效的基因载体,它具有良好的DNA负载能力、高效的细胞摄取和内涵体/溶酶体逃逸能力,这些特性有利于实现高效的基因转染。然而,由于PEI的不可生物降解特性和高细胞毒性,容易导致细胞死亡,而阻碍了其临床应用。为了实现安全和有效的基因递送,设计合成生物可降解和生物相容性良好的非病毒基因载体极为重要。最近,可响应细胞环境中发生的任何变化的智能聚合物引起了研究人员的兴趣,即利用这些材料作为基因载体。其中,具有氧化还原性的阳离子聚合物能够对细胞内、外环境的差异而产生特定响应。细胞质中含有谷胱甘肽（GSH）而具有一定的还原性,使得二硫键能够对细胞质内还原环境实现特定响应。此类聚合物从细胞外部环境进入内部过程中,其含有的二硫键能够被有效还原。这使得聚合物载体不仅在细胞外具有良好的稳定性和长循环能力,而且也能在细胞质中的还原环境中实现DNA的有效释放。本论文开展了还原可降解基因载体的合成和转染性能表征,主要研究内容和结果如下。1.为了实现高效基因转染目标,我们合成了一种生物可还原性的阳离子聚合物:聚乙二醇-聚双硫赖氨酸（PEG-SSL）。该聚合物含有PEG链段不仅能够有效提高聚合物/p DNA复合物的生物相容性,还能提供良好的胶束稳定性,有利于延长复合物的循环时间。PEG的高渗透、长滞留效应有效促进复合物的细胞摄取。聚L-赖氨酸（PLL）由赖氨酸重复单元组成,并通过含有部分双（丙稀酰）胱胺的双硫键连接起来。该PEG-SSL具有双重功能,一方面L-赖氨酸的正电性实现了其对DNA的有效负载,另一方面双硫键在细胞质的还原性环境中的裂解促进了DNA快速释放。通过四丙烯酰基官能化的聚乙二醇（PEG（Ac）4）和聚双硫赖氨酸的末端胺基之间的迈克尔加成反应,制备得到聚乙二醇-聚双硫赖氨酸（PEG-SSL）。通过~1HNMR光谱证实了聚合物的成功制备。通过凝胶渗透色谱法（GPC）测定平均分子量,PEG-SSL相对分子质量27.8 k Da。PEG-SSL聚合物载体良好的缓冲能力能够帮助p DNA从内涵体逃逸,从而避免受降解。通过酸碱滴定法评价PEG-SSL聚合物的缓冲能力,即通过0.05 M HCl溶液滴定调节PEG-SSL溶液p H从10到2,评价该聚合物的缓冲容量。结果表明,PEG-SSL表现出良好的缓冲能力,特别是在p H在5.1至7.4范围内。PEG-SSL阳离子基因复合物可通过质子海绵效应有效地保护p DNA免受酶解,从而表现高基因转染。质子海绵效应还会诱导溶酶体中质子和氯离子的积累,导致溶酶体膨胀和破裂,从而释放出其内容物。PEG-SSL可以保护p DNA免受溶酶体的降解。动态光散射（DLS）研究表明在聚合物/DNA质量比为5/1到10/1时,该聚合物/p DNA复合物的粒径在155±4到285±3 nm之间。在高质量比（80/1）下,PEG-SSL/p ZNF580形成较小尺寸的复合物（155±4 nm）。这些结果表明,随着PEG-SSL聚合物质量比的增加,PEG-SSL/p ZNF580形成复合物尺寸减小。此外,当聚合物/DNA重量比从5/1增加到80/1时,复合物的表面zeta电位从1.9±0.1增加到26.7±0.4 m V。在测定的所有质量比下,PEG-SSL/p ZNF580复合物均具有正zeta电位。PEG-SSL/p ZNF580复合物的较小zeta电位可能是由于PEG的存在,其平衡了复合物上的正电荷,因此降低了它们的zeta电位。因此,PEG-SSL能够有效包裹p ZNF580质粒并形成正电性的纳米尺寸的复合物。通过胶束稳定性实验,将不同质量比（30/1,50/1和80/1）的PEG-SSL聚合物在磷酸缓冲液（20 m M,p H 7.4）以及Na Cl溶液（150 m M）中37℃孵育不同时间（0,4,12,24小时）后,测定其粒径大小。结果表明,新鲜制备的PEG-SSL/p ZNF580复合物粒径在155-195 nm之间。在孵育4小时和12小时后,粒径的增加几乎可以忽略不计。在孵育24小时后,观察到粒度稍有增加（约为295-350nm）。这些结果表明PEG-SSL/p ZNF580复合物表现出更好的胶束稳定性,即使在孵育24小时后也能够稳定存在,不会聚集形成较大颗粒。此外,通过将PEG-SSL/p ZNF580复合物在20μM和5 m M DTT的溶液中（磷酸盐缓冲液,p H 7.4）进行孵育,来分别模拟生理条件下细胞外和细胞内环境。结果表明,在37℃温育1小时后,20μM DTT溶液对粒径没有显著影响。但是,在5 m M DTT溶液中孵育后,尺寸显著增加,甚至超过500 nm。粒度的突然增加是由于PEG-SSL聚合物链中的二硫键断裂,使聚合物降解成小片段。这些小片段具有较少正电荷,无法有效负载和压缩较大的DNA分子,从而导致复合物颗粒较为松散,具有大尺寸。这些结果表明PEG-SSL聚合物在细胞外环境中稳定,因为GSH的细胞外浓度（2μM）不足以还原二硫键。然而,细胞内GSH浓度（0.5-20 m M）足以导致二硫键被还原。因此,细胞外环境中的良好稳定性和细胞质中二硫键的响应性降解实现DNA的有效释放。凝胶电泳实验用来评价PEG-SSL聚合物的DNA负载能力以及复合物的稳定性。结果表明,当质量比大于10/1后,PEG-SSL载体均能有效包裹p ZNF580质粒。一方面,聚合物/p DNA复合物在20μM DTT溶液中仍没有明显的DNA释放。即使在聚合物/DNA的质量比较高（20/1）的情况下,聚合物/p DNA复合物仍能稳定存在。因为低浓度的DTT（20μM）不足以完全破坏二硫键。PEG-SSL聚合物的良好稳定性可在DNA周围提供保护层以形成稳定的复合物。这些结果表明,PEG-SSL聚合物可在细胞外环境和血液循环过程中有效保护DNA。另一方面,当聚合物/p DNA复合物在5 m M DTT溶液中,DNA能够得到有效释放,甚至在聚合物/DNA的质量比较高（60/1和80/1）的情况下,也能快速释放DNA。这些结果表明,PEG-SSL聚合物不仅能够在细胞外部环境中有效负载DNA,而且能够在细胞质的还原性环境中实现二硫键的断裂,进而有效释放DNA。通过DNase I酶降解实验,将不同质量比（10/1和20/1）的PEG-SSL/p ZNF580复合物在含有DNase I溶液中孵育不同时间（0、20、40、60和120分钟）,进而考察了该复合物的DNase I稳定性。结果表明,裸p DNA在含DNase溶液中孵育20分钟内被完全降解。相反,PEG-SSL/p ZNF580（10/1）复合物保护负载的p DNA免受DNase降解长达40分钟。当质量比为20/1时,其DNA保护时间延长到120分钟。这些结果证明PEG-SSL/p ZNF580聚合物具有良好的DNase I稳定性,能够有效保护p DNA不被酶解。此外,PEG-SSL/p ZNF580的高质量比有利于DNA保护免受DNA酶解。非病毒载体在生理条件下的不稳定性是导致低转染效率的原因之一。用于基因递送的大多数阳离子聚合物形成致密的聚合复合物,但这些复合物是胶束不稳定的。然而,PEG-SSL聚合物良好稳定性有助于DNA从内涵体逃逸,进而实现高效基因转染。以EA.hy926为模型细胞,考察了PEG-SSL/p ZNF580复合物的体外转染效率和细胞毒性。结果表明,随着PEG-SSL/p ZNF580的重量比从20/1增加到60/1,其转染效率随之增加。在重量比为80/1时有所下降,这可能因为p ZNF580被PEG-SSL包裹紧实,不能完全释放。在重量比为60/1时,PEG-SSL/p ZNF580复合物表现出最大转染,几乎等同于PEI25k Da/p ZNF580复合物的转染效率。MTT实验测定了PEG-SSL及其基因复合物在EA.hy926中的细胞毒性。用浓度为50-800μg/m L的PEG-SSL聚合物溶液和重量比分别为20/1,40/1,50/1,60/1和80/1的PEG-SSL/p ZNF580复合物溶液分别处理EA.hy926细胞,结果表明,PEG-SSL聚合物在相同重量比下比其复合物毒性更大。聚合物的高细胞毒性可能是由于聚合物的高zeta电位。而带负电的DNA中和了阳离子聚合物上的正电荷,使得基因复合物电位有所降低,毒性减小。PEG-SSL/p ZNF580复合物显示出比PEI25k Da/p ZNF580复合物显着更低的毒性。在重量比为20/1时,PEG-SSL/p ZNF580复合物显示出超过90%的细胞存活率,而在该比例下的PEI25k Da/p ZNF580组显示小于25%。在高重量比（80/1）下,PEG-SSL/p ZNF580复合物毒性较低,细胞活力为80%,而PEI25k Da/p ZNF580复合物的细胞活小于10%。从MTT测定结果得出,可还原性PEG-SSL聚合物的毒性低于PEI25k Da。这一方面可能是因为PEG的存在,改善了聚合物的生物相容性。另一方面与PEI25k Da不同的是,PEG-SSL可生物降解且产生的有害副产物较少。因此,PEG-SSL载体能够成功将p ZNF580递送进入EA.hy926细胞,且相比PEI25k Da具有较小的细胞毒性。流式细胞分析结果表明,PEG-SSL/Cy5-寡核苷酸复合物表现出良好的细胞摄取。裸Cy5-寡核苷酸几乎没有细胞摄取,而PEG-SSL/Cy5-寡核苷酸复合物表现出显着高的细胞摄取。细胞摄取结果表明PEG-SSL和PEI25k Da组的摄取率相当,均高于97%。PEG-SSL/Cy5-寡核苷酸复合物的平均荧光强度随着重量比的增加而增加。这些结果表明PEG-SSL/Cy5-寡核苷酸复合物有良好的细胞摄取能力。共聚焦扫描激光显微（CLSM）技术用于定位研究复合物在细胞中的递送过程。结果表明,裸p DNA几乎不能被内化到细胞中。然而,PEG-SSL/Cy5-寡核苷酸复合物不仅表现出良好的细胞吸收,而且能有效地从内涵体中逃逸并聚集在核周区域。CSLM的结果表明,具有高重量比的PEG-SSL/Cy5-寡核苷酸复合物容易进入细胞,然后在核周区域积累。当孵育时间从4小时延长至24小时,PEG-SSL/Cy5-寡核苷酸（60/1）组的内涵体共定位率（CLR）从3.5±0.7%降至1.9±0.9%,而细胞核CLR从5.0±1.4%增加至8.5±1.4%。这些结果表明Cy5-寡核苷酸在PEG-SSL的负载下,能够从内涵体成功逃逸并进入细胞核。综上所述,PEG-SSL聚合物能够有效负载p DNA,并形成具有正zeta电位的复合物,该复合物在PBS溶液中具有良好的稳定性。PEG-SSL能够有效地保护p DNA免受DNase I酶解,并且表现出还原响应特性。PEG-SSL聚合物及其复合物具有良好的生物相容性和低细胞毒性。流式细胞术和CLSM分析结果证明,复合物不仅表现出良好的摄取,而且可以有效地从内涵体中逃逸,在细胞核周围积聚,然后进入细胞核。因此,PEG-SSL聚合物有望用作一种安全、高效的基因载体。2.在第二部分中,我们制备得到了可还原性双硫官能化的低分子量聚乙烯亚胺(简写SS-PEI 1.8 k Da。SS-PEI通过缩聚反应而得到,将低分子量PEI（Mw=1.8k Da）通过双硫键连接得到具有还原性的PEI基聚合物。用双-（对硝基苯）-3,3-二巯基丙酸酯处理低分子量PEI进行缩聚反应得到高分子量SS-PEI。将该聚合物作为非病毒基因载体并进行了性能评价。通过核磁共振氢谱（~1HNMR）和凝胶渗透色谱（GPC）进行了聚合物的结构和分子量分析。SS-PEI的~1HNMR光谱中没有发现芳香质子峰,表明PEI通过酰胺键成功地与DTPA-PCN连接。GPC结果表明,SS-PEI的重均分子量（Mw）为28.94k Da,数均分子量（Mn）为11.71k Da,多分散指数（PDI）值为2.47。通过粒径和zeta电位测量,分析了聚合物/DNA复合物的理化性质。结果表明,这些聚合物/DNA复合物的粒径范围为170±1.5至255±1.6 nm,zeta电位为3±0.4至17±0.9m V。这些结果与凝胶阻滞测定的结果一致,表明在SS-PEI聚合物重量比小于1时,不能有效负载DNA。复合物的大小和zeta电位取决于SS-PEI的聚合物/DNA的质量比。聚合物/DNA复合物通过阳离子聚合物和p DNA之间的静电相互作用结合,复合物的小尺寸和正电荷将促进复合物进入细胞,进而改善基因表达。低分子量PEI即使在较高的N/P比率下,也无法有效负载DNA而形成复合物。研究结果表明SS-PEI（1.8k Da）表现出优异的基因负载能力,并形成表面带正电荷的聚合物/DNA复合物。凝胶电泳结果表明,在重量比（0.5/1）下,SS-PEI不能完全负载p ZNF580质粒（p DNA）。但当质量比大于1后,SS-PEI载体能有效包裹p DNA,即SS-PEI和p DNA之间表现出良好的静电相互作用。随着聚合物/p DNA复合物中聚合物的重量比的增加,p DNA的负载能力增加。结果证明SS-PEI能够有效包裹p ZNF580质粒。DTT实验采用5 m M DTT溶液来模拟细胞内部环境,结果证实了p DNA在细胞质的还原环境中能够快速释放。由于阳离子聚合物的高正电荷和不可降解性质,p DNA通常保持完整或被包埋在聚合物基质中,最后被酶解,这对转染效率产生不利影响。然而,SS-PEI聚合物能够当从细胞外转移到细胞内环境时,被裂解形成小聚合物片段,从而实现DNA的高效释放,避免酶解。同时,结果表明二硫键的裂解受DTT浓度的影响。这些结果表明SS-PEI形成稳定的纳米级聚合物/DNA复合物,这很容易内化到细胞中。通过酸碱滴定法测量聚合物的缓冲容量。结果表明,SS-PEI聚合物表现出与PEI25k Da相当的缓冲能力,而良好的缓冲能力能够有效保护p DNA免受DNase I降解。SS-PEI和PEK25k Da的滴定曲线表明,需要几乎相同量的酸溶液才能使SS-PEI和PEI25k Da溶液的p H值发生相同变化。这些结果验证了SS-PEI可以通过质子海绵效应保护p DNA免受溶酶体降解,进而促进基因表达。SS-PEI不仅表现出良好的缓冲能力,还能有效地保护p ZNF580免于DNase I的酶解。通过将SS-PEI/p ZNF580复合物孵育于DNase I缓冲液,来研究SS-PEI保护p DNA免于DNA酶解的能力。结果表明,裸p ZNF580在20分钟内就被DNase快速降解。但是,当它与SS-PEI复合后,p ZNF580被很好地保护。当聚合物/DNA的重量比为2/1时,p DNA保护时间增加至120分钟。这些结果表明SS-PEI/p ZNF580复合物在DNase中是稳定的,并且保护DNA免于DNase I的酶解。因此,SS-PEI不仅保护DNA免受酸降解,还能够在早期内涵体中释放它们,以防止被DNase酶解。因此SS-PEI不仅表现出良好的缓冲能力,还能有效地保护p ZNF580免于DNase I的酶解。以EA.hy926为模型细胞进行SS-PEI的转染效率的评价。结果表明,SS-PEI在EA.hy926细胞中表现出良好的转染效率。与裸p ZNF580不同的是,在所有SS-PEI基因递送系统中均观察到大量EGFP荧光的表达。流式定量转染结果表明,SS-PEI表现出和与PEI25k Da相当的转染效率。通过增加SS-PEI/p ZNF580复合物中SS-PEI聚合物的重量比,转染效率随之增加。在重量比为4/1时观察到最高的转染效率,同时,细胞存活率超过80%。SS-PEI在复合物中的重量比越高,其对EA.hy926细胞的毒性也更大,还注意到,SS-PEI的细胞毒性低于PEI25k Da的细胞毒性。SS-PEI中含有的二硫键具有还原响应特性,有助于p DNA从内涵体逃逸,从而提高基因表达。MTT实验结果表明,SS-PEI载体及其基因复合物的具有较小的细胞毒性。随着聚合物及其复合物浓度的增加,聚合物及其复合物的细胞毒性都相应增加。在SS-PEI聚合物为15和75μg/m L的浓度下,表现出88%和63%的细胞活力;而在相同浓度下,PEI25k Da分别表现出35%和20%。这些结果表明SS-PEI聚合物表现出比PEI25k Da更低的细胞毒性。SS-PEI/p ZNF580和PEI25k Da/p ZNF580复合物在相同浓度下都显示出比相应聚合物更小的细胞毒性。这可能是由于与DNA复合后阳离子聚合物上的正电荷被部分中和。在SS-PEI/p ZNF580重量比为1/1和5/1时,细胞存活率分别为95%和80%。然而,在相同的比例下,PEI25k Da分别仅表现出50%和20%的细胞活力。随着SS-PEI聚合物的重量比在复合物中比例的增加,SS-PEI/p ZNF580复合物的细胞毒性也随着增加,但是,均远小于PEI25k Da。因此,SS-PEI载体及其基因复合物的具有较小的细胞毒性。CLSM技术通过Cy5标记的寡核苷酸来实现SS-PEI/p DNA的胞内定位,来观察SS-PEI/Cy5-寡核苷酸复合物的细胞内运输。将细胞与SS-PEI/Cy5-寡核苷酸和PEI25k Da/Cy5-寡核苷酸复合物分别孵育4和24小时。利用Hoechst 33342和Lyso Tracker Green进行细胞核和内涵体的标记,使其在显微镜下呈现蓝色和绿色。结果表明,在1/1的重量比下,SS-PEI/Cy5-寡核苷酸复合物显示出充分的细胞内化。并且,在该比例下,该复合物表现出良好的核共定位率为15.4±0.8%。在3/1和4/1的重量比时,核共定位率为54.1±0.7%和61.7±1.0%。当孵育时间从4小时延长到24小时,核共定位率分别增加到71.4±1.0%和72.6±2.0%。SS-PEI能够有效递送p DNA进入细胞,并聚集在细胞核周围,最终进入核内。这些结果表明SS-PEI/Cy5-寡核苷酸复合物在内化后成功地从内/溶酶体中逃逸并进入细胞核。综上所述,SS-PEI有效地负载DNA以形成具有正zeta电位的纳米尺寸复合物。SS-PEI聚合物表现出良好的缓冲能力和p DNA保护能力。SS-PEI能够响应5m M DTT溶液模拟的细胞内的还原环境。然后通过二硫键的裂解有效释放p DNA。SS-PEI/p ZNF580复合物在EA.hy926中表现出良好的细胞摄取和基因表达。同时与PEI25k Da组相比,该复合物具有较低的细胞毒性。共聚焦显微镜分析表明SS-PEI/Cy5-寡核苷酸复合物显示出比PEI25k Da/Cy5-寡核苷酸复合物更好的细胞内化和核共定位率。因此,SS-PEI是一种具有良好应用前景的基因载体。本论文设计合成的PEG-SSL和SS-PEI两种聚合物,他们能够有效地将p DNA递送到EA.hy926细胞,同时保持高细胞活性。因此,这两种聚合物均具有良好的基因递送前景。