产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）是一种革兰阳性病原菌,存在于自然界以及人和动物的胃肠道,可引起人食物中毒、气性坏疽、胃肠疾病以及肝和肾损伤,动物的坏疽性皮炎、牛羊猪禽的坏死性肠炎（NE）以及牛羊的肠毒血症。近几十年来,产气荚膜梭菌病给全球畜牧养殖业造成了严重的经济损失。F型菌可引起人类食物中毒和许多非食源性人类胃肠道（GI）疾病。产气荚膜梭菌肠毒素（Clostridium perfringens enterotoxin,CPE）基因位于染色体的F型菌易引起人类食物中毒,而cpe位于质粒的F型菌与非食源性人类GI疾病相关。因此,确定cpe位于染色体或质粒上对疾病的诊断和防控具有重要意义。当cpe位于染色体上时其下游携带IS1470序列;当cpe位于质粒上时其下游携带IS1470-like或IS1151序列。通过IS1470、IS1470-like和IS1151及其cpe序列的检测,可以确定部分cpe+菌的cpe位置。超氧化物歧化酶（SOD）基因具有保守性和致病性,与cpe距离较远不会受到cpe移动的影响。通过sod和sod内引物对（sod FPF）的PCR检测及单位点序列分型（SLST）分析可以确定分离菌株cpe的位置。本研究拟建立产气荚膜梭菌六重PCR分型检测方法并进行分离菌株的cpe定位研究。获得以下结果:1.产气荚膜梭菌六重PCR分型检测方法的建立分别合成6个毒素基因的引物,以A～G型菌的基因组DNA为模板,对退火温度和引物浓度进行优化,结果显示最适退火温度为57.3℃,cpa、cpb、etx、ia、cpe和net B的引物浓度分别为0.8μmol/L、1.2μmol/L、1.8μmol/L、1.8μmol/L、1.0μmol/L和1.2μmol/L时的扩增效果最好。特异性试验显示A～G型菌均能扩增出目的条带,而腐败梭菌（Clostridium putrificum）、蜡样芽胞杆菌（Bacucilius cereus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）和肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）的检测结果均为阴性。DNA敏感性试验显示B、E、F和G型菌的最低检测量分别为445 pg/μL、41.6 pg/μL、380 pg/μL和3.75 ng/μL;菌液敏感性试验显示B、E、F和G型菌的最低检测量分别为4.9×10~5CFU/m L、5.8×10~4CFU/m L、6.5×10~5CFU/m L和2.4×10~5CFU/m L。稳定性试验显示六重PCR分型检测方法重复性好。应用建立的六重PCR方法进行已知型别的产气荚膜梭菌分型检测,结果显示被检测菌株的毒素基因型与之前分型结果完全一致。本研究成功建立产气荚膜梭菌六重PCR分型检测方法。2.分离菌株的cpe定位分别应用针对IS1470、IS1470-like、IS1151及其cpe序列的双重PCR方法检测分离菌株的cpe下游是否携带扩增长度为1 300 bp的IS1470、扩增长度为1 600 bp的IS1470-like或扩增长度为800 bp的IS1151序列,结果显示29株cpe+菌仅扩增出600bp的条带,未检测出以上3个序列,未能确定cpe的位置。应用常规PCR检测sod,结果显示cpe+菌均扩增出347 bp的条带。SLST分析结果显示分离菌株共有15个分支,其中2个分支分别包含6株和7株菌。除A190926-2的cpe可能位于质粒上和A190925的cpe位置无法推断外,其余27株菌的cpe可能均位于染色体上。应用sod FPF检测sod,结果显示29株cpe+菌均扩增出350 bp的条带。SLST分析显示菌株共有4个分支,分别包含13株、8株、5株和3株菌。在染色体上携带cpe的菌株与在质粒上携带cpe的菌株位于不同的聚类群,上述27株菌均与在染色体上携带cpe的参考菌株亲缘关系近。A190926-2和A190925位于同一分支,与在染色体上携带cpe的参考菌株亲缘关系近且与4株在质粒上携带cpe的参考菌株距离远。通过sod FPF检测及SLST综合分析确定29株菌的cpe均位于染色体上。综上所述,本研究成功建立产气荚膜梭菌六重PCR分型检测方法并确定分离菌株的cpe位置,为产气荚膜梭菌病的流行病学调查和防控、F型菌引起食物中毒和非食源性疾病的诊断和防控以及cpe+菌生物学特性的研究提供材料和科学依据。