【摘 要】
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目的:通过体内实验建立中药干预的喉鳞癌裸鼠皮下移植瘤模型,浅析补中益气方对移植人喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)细胞的裸鼠皮下移植瘤组织中PI3K、p-PI3K、AKT1、p-AKT1、m TOR、p-m TOR蛋白表达的影响,探索补中益气方是通过PI3K-AKT1-m TOR通路部分抑制喉鳞癌发生、进展的机制。方法:选择SPF级裸鼠雌雄
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目的:通过体内实验建立中药干预的喉鳞癌裸鼠皮下移植瘤模型,浅析补中益气方对移植人喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)细胞的裸鼠皮下移植瘤组织中PI3K、p-PI3K、AKT1、p-AKT1、m TOR、p-m TOR蛋白表达的影响,探索补中益气方是通过PI3K-AKT1-m TOR通路部分抑制喉鳞癌发生、进展的机制。方法:选择SPF级裸鼠雌雄各半共40只,将预先培养好的Fadu LSCC细胞培养液调整至实验标准的体积浓度,用Fadu细胞对裸鼠进行皮下注射,建立LSCC动物模型,造模成功后,将裸小鼠随机分为对照组(生理盐水)及补中益气汤低、中、高剂量剂量实验组。造模一周后,开始灌胃,其中对照组灌生理盐水,低、中、高剂量组灌胃浓度分别为:0.378g/ml、0.756g/ml;1.134g/ml,每只小鼠固定给药剂量0.5ml,每天灌胃1次,持续2周。每日检查肿瘤形态,观察小鼠饮水、进食、精神状况等。瘤体长出表示造模成功,每隔三日用游标卡尺测出可移植肿瘤的最大长径(L)和横径(S)并计算移植瘤体积。最后一次灌胃后,处死裸鼠,剥离瘤体,记录移植瘤重量及体积。运用苏-伊红(HE)染色法,观察瘤体的病理形态变化;蛋白免疫印记法检测瘤体内PI3K、p-PI3K、AKT1、p-AKT1、m TOR、p-m TOR蛋白的表达,最终进行统计学分析。结果:(1)瘤体长出后,各组BALB/c小鼠状态尚可,未见明显的肿瘤排斥反应,如抗拒、烦躁、二便异常等症状。在各组中,高剂量补中益气汤组在19天(Day,D)后瘤体体积逐渐减小,22d后缩小更为显著,与对照组相比有统计学差异(P<0.01);而中剂量补中益气汤组、低剂量补中益气汤组与对照组相比,在灌胃的各个时间节点,移植瘤体积无明显组间差异(P>0.05)。补中益气汤高剂量组瘤体体积减小的幅度与给药时间的增长及药物浓度的累加有明显的关联,进而推测补中益气汤作用于瘤体有明显的时间及浓度依赖性。在第22天时,高剂量组小鼠体重明显比对照组降低,且差异具有统计学意义(P<0.05)。而中、低剂量组与对照组,及中、低剂量组与高剂量组在各个时段的裸鼠重量,均无明显差异(P>0.05)。在灌胃14天后,剥离瘤体,高剂量组瘤体体重明显低于对照组瘤重(P<0.05)。(2)HE结果显示:对照组镜下见肿瘤组织包膜完整,包膜处见少量炎性细胞;低剂量组镜下肿瘤组织包膜不完整,包膜处见有少量炎性细胞。中剂量组镜下两块瘤组织,包膜均较完整,左下方向的瘤组织块已大面积坏死,仅边缘区残留部分瘤细胞。高剂量组镜下见肿瘤组织包膜完整,包膜下方瘤组织被纤维组织分割呈多个小叶,小叶内中心多见坏死灶,坏死灶大小不等。(3)Western Blot检测蛋白表达:与对照组相比,在高剂量补中益气汤组中,p-PI3K、p-AKT、p-m TOR表达量均有明显降低,且差异具有统计学意义(P<0.05)。与低剂量组相比,高剂量组的p-PI3K、p-m TOR蛋白表达量均有不同程度下降,且存在明显差异(P<0.05)。对照组与中、低剂量组及高剂量组与中剂量组相比,p-PI3K、p-AKT、p-m TOR蛋白表达量均无明显差异(P>0.05)。对照组及实验组中,PI3K、AKT、m TOR蛋白水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1.补中益气方能明显抑制喉鳞状细胞癌裸鼠皮下移植瘤瘤体的生长,且推测其与给药浓度及给药时间呈正相关性;2.PI3K、AKT、m TOR可能是喉鳞状细胞癌进展过程的关键靶点之一,其机理或是通过靶向下调磷酸化PI3K-AKT1-m TOR通路相关蛋白的表达,从而抑制喉鳞状细胞癌的增殖。
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