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背景:神经母细胞瘤来源于交感神经系统,是小儿最常见的颅外实体恶性肿瘤,其发病率及死亡率均较高,对患儿及其家庭影响很大。高度异质性是神经母细胞瘤主要特点之一,临床上根据风险因素指标的不同将神经母细胞瘤划分为低危组、中危组和高危组。低、中危组患儿预后较好,但对于高危组患儿而言,即使综合多种治疗方案,其预后仍不理想,目前针对神经母细胞瘤的治疗仍是临床研究的难点。微管蛋白是中心体和纺锤体的基本结构单位,在细胞有丝分裂过程中发挥重要作用。研究表明微管蛋白在神经母细胞瘤中特异表达,且可作为该肿瘤的特异治疗靶点。HAUS5是人类Augmin复合物的亚基之一,主要参与纺锤体组装,维持中心体完整以及胞质分裂等过程。HAUS5表达异常可诱导中心体的微管片段化以及中心体体积的增大,导致染色体错位以及双极纺锤体功能缺陷等,而双极纺锤体的异常又可诱发肿瘤形成。据国外研究报道,敲减HAUS5基因可抑制胶质母细胞瘤干细胞样细胞增殖以及肿瘤形成能力。综上,HAUS5有可能对神经母细胞瘤的发生、发展起作用,然而目前国内外对HAUS5在神经母细胞瘤组织中表达状况,及其在神经母细胞瘤中的作用影响等方面研究尚不足。目的:本研究通过免疫组化方法检测HAUS5在神经母细胞瘤肿瘤组织及瘤旁正常组织中的表达情况;通过敲减神经母细胞瘤细胞中HAUS5基因并对其进行细胞功能检测,进一步研究HAUS5对神经母细胞瘤细胞增殖、细胞凋亡、细胞克隆等功能的影响,以期了解HAUS5对神经母细胞瘤发生、发展的影响。方法:1.HAUS5在神经母细胞瘤肿瘤及瘤旁组织中表达状况收集14例神经母细胞瘤患儿的肿瘤组织及瘤旁正常组织,应用免疫组化检测HAUS5在神经母细胞瘤肿瘤组织及瘤旁组织的表达情况。2.HAUS5对神经母细胞瘤细胞生物学行为的影响(1)RT-qPCR法检测两种神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y和SK-N-AS中HAUS5基因表达情况,以测得的Δ Ct值来表示HAUS5在细胞中表达丰度的高低;(2)以HAUS5基因为模板,设计RNA干扰靶点序列,构建HAUS5基因RNA干扰慢病毒载体;(3)RT-qPCR检测HAUS5基因敲减效率,敲减成功后用慢病毒感染神经母细胞瘤细胞系SK-N-AS细胞,并以加入阴性对照病毒感染的细胞组为对照组(shCtrl组),以加HAUS5基因shRNA慢病毒感染的细胞组为实验组(shHAUS5组),对两组细胞进行培养;(4)采用Celigo细胞计数法、MTT法、流式细胞仪细胞凋亡检测、细胞克隆形成能力检测等方法检测敲减HAUS5对神经母细胞瘤细胞功能的影响。3.统计学方法应用SPSS21.0统计软件处理数据,数据进行正态分布检验,不符合正态分布的计量资料应用Mann-Whitney U秩和检验方法进行判断,符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示,组间采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果:(1)免疫组化检测结果显示,14例神经母细胞瘤肿瘤组织中有6例HAUS5为阴性表达,6例为低表达,2例为高表达;14例瘤旁组织中有6例HAUS5为阴性表达,7例为低表达,1例为高表达。经Mann-WhitneyU检验:P=0.734,考虑HAUS5蛋白在神经母细胞瘤肿瘤组织中的表达量不高于瘤旁组织,两组间差异无统计学意义。(2)HAUS5基因在SH-SY5Y和SK-N-AS两种细胞中的ΔCt值均值分别为10.05和9.57,均小于12,说明HAUS5基因在两组细胞中表达丰度均高。(3)RT-qPCR结果提示,shRNA慢病毒感染后实验组SK-N-AS细胞中HAUS5基因在mRNA水平的表达量明显受到抑制(p<0.05),敲减效率达到68.2%,HAUS5基因敲减成功。(4)Celigo细胞计数法检测结果:敲减HAUS5基因后shHAUS5组较shCtrl组SK-N-AS细胞的增殖数量显著减少,增殖速率明显受到抑制(P<0.05),组间差异比较有统计学意义。(5)MTT法检测结果:敲减HAUS5基因后shHAUS5组较shCtrl组SK-N-AS细胞的活力及增殖能力受到显著抑制(P<0.05),差异有统计学意义。(6)细胞凋亡检测结果:应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,敲减HAUS5基因后shHAUS5组较shCtrl组SK-N-AS细胞凋亡比例增高(P<0.01),两组间比较有显著差异。(7)细胞克隆形成检测:敲减HAUS5基因后shHAUS5组较shCtrl组SK-N-AS细胞克隆形成能力下降(P<0.01),差异有统计学意义。结论:(1)本实验中HAUS5在神经母细胞瘤肿瘤组织中非高水平表达。(2)HAUS5基因在神经母细胞瘤细胞系中转录水平高。(3)敲减HAUS5基因可抑制神经母细胞瘤细胞活性、细胞增殖能力和细胞克隆形成能力,并促进细胞凋亡发生。