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研究背景癌症一直是人类医学研究中主要攻克疾病之一,卵巢癌作为严重威胁女性健康的肿瘤疾病,患者总生存率处于较低水平,究其原因主要有两点:一是该疾病早期以非特异性症状为主,无法及时识别卵巢肿瘤的发生,许多卵巢癌患者首次诊断时即被诊断为卵巢癌中晚期;二是目前卵巢癌对于一线抗癌药的耐药性逐渐增加,导致卵巢癌患者预后差。因此,尚需及时寻找新的可控制卵巢肿瘤发生转移的有效干预点,进而改善其预后和生存质量。STEAP1(Six-transmembrane epithelial antigen of the prostate 1)是一种六次跨膜蛋白,因其首先在前列腺癌中被发现,所以被命名为前列腺六次跨膜蛋白1,属于STEAP家族成员之一,研究报告称在细胞与周围细胞间进行信号传导以及一些较小分子进入细胞过程中,STEAP1蛋白发挥了重要的作用,以维持细胞正常的生理活动,也可能参与铁代谢,并与癌症的侵袭转移发生相关等。STEAP1在诸多癌症组织中高表达,如:人前列腺癌、结直肠癌、肺癌等。在STEAP1应用于前列腺癌的诊治方面,有研究者将Anti-STEAP1抗体用于辅助诊断前列腺癌,利于精准确定前列腺癌病灶位置;另外,在前列腺癌小鼠体内,Anti-STEAP1抑制了前列腺癌体内生长与转移。据最新的研究报道,以STEAP1作为治疗靶点的相关癌症治疗手段已取得良好实验效果,如:DNA疫苗、特异性抗体、外源性抑制STEAP1蛋白表达等。人卵巢肿瘤中STEAP1蛋白表达尚未被研究者报道,该蛋白在卵巢肿瘤中是否存在临床价值,能否用于改善肿瘤发生发展甚至是转移结局,目前尚未可知。研究目的本研究通过多种实验方法和技术手段,重点阐明人类卵巢癌中STEAP1表达以及与组织病理、生存之间的联系,并且进一步探讨STEAP1是否对卵巢癌侵袭转移,特别是上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程产生影响。研究方法1、使用Oncomine和Kaplan-Meier Plotter公开数据库查询STEAP1在卵巢癌患者中mRNA与患者生存率的联系;2、本研究使用免疫组织化学方法来比较人类正常卵巢组织和不同发展程度卵巢肿瘤中STEAP1差异化表达,并与患者不同病理特征是否相关;3、运用RT-qPCR检测卵巢癌细胞OVCAR-3、CAOV-3、SKOV-3和ES-2四种细胞系中STEAP1的mRNA,并利用蛋白免疫印迹法、免疫细胞化学法测量STEAP1蛋白在四种细胞中的含量;4、上述四种细胞系体外迁移、侵袭差异由Transwell小室实验结果体现;5、使用慢病毒转染技术,利用shRNA敲低ES-2中STEAP1的表达,升高OVCAR-3中STEAP1表达量,从而获得调控后稳定表达STEAP1的ES-2 shRNA、OVCAR-3 EX,并检测调控STEAP1表达对两种细胞系体外侵袭迁移的影响;6、流式细胞术可反映调节STEAP1后细胞凋亡的改变,平板克隆反映集落形成能力,生长曲线则反映了体外增殖的变化,裸鼠移植瘤实验通过接种癌细胞的方式检测其裸鼠皮下生长能力;7、RT-qPCR、蛋白免疫印迹和明胶酶谱实验综合反映STEAP1与肿瘤侵袭转移密切相关的上皮-间质转化中重要指标(包括MMP9、MMP2活性)的变化情况,以探讨调控STEAP1表达对EMT进程的影响。研究结果1、Oncomine公开数据库查询结果显示卵巢癌STEAP1呈现高表达,Kaplan Meier-plotter数据库表明STEAP1低表达的卵巢癌患者无进展生存期显著高于STEAP1过表达患者,即60个月无进展生存时间内STEAP1高表达风险比为1.21(CI:1.05-1.38),logrank P=0.0067:120个月无进展生存期内依然是显著的危险因素,风险比 HR=1.2(CI:1.06-1.37),logrank P=0.0056:2、STEAP1在正常卵巢和良性组织中含量低,而在恶性组织中表达高,并且经过分析得出,该蛋白高表达可能预示着患者存在着低分化、高分期以及淋巴转移等不良病理特征(P<0.05);3、STEAP1在ES-2、SKOV-3、CAOV-3和OVCAR-3含量逐渐减少,并且侵袭迁移能力亦依次减弱(P<0.05);4、ES-2、OVCAR-3 转染后分别得到 ES-2 shRNA、OVCAR-3 EX 细胞,并且ES-2 shRNA侵袭迁移能力显著弱于ES-2,OVCAR-3 EX侵袭迁移能力明显强于OVCAR-3(P<0.05);5、转染后ES-2 shRNA细胞克隆形成能力、体外生长速度和裸鼠皮下移植瘤生长速度显著减弱,凋亡率增高(P<0.05),而OVCAR-3 EX各种能力变化则与之相反(P<0.05);6、RT-qPCR、蛋白免疫印迹和明胶酶谱实验结果:ES-2细胞的STEAP1降表达后,EMT 相关的重要指标蛋白 Vimentin、N-cadherin、ZEB1、Twist、Snail、Slug、MMP2、MMP9 等减少,E-cadherin 升高,EMT 进程减弱;而 OVCAR-3 中 STEAP1过表达后,Vimentin、N-cadherin、ZEB1、Twist、Snail、Slug、MMP2、MMP9增强,E-cadherin减少,EMT进程有所增强。研究结论1、STEAP1在人类卵巢癌呈现高表达,并与患者恶性病理特征、不良生存有关:2、STEAP1降表达通过抑制EMT、增殖能力,以及促凋亡实现下调卵巢癌的转移能力;3、STEAP1可能成为抑制卵巢癌转移的潜在作用靶点,值得深入研究,从而改善预后。