【摘 要】
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硫化叶菌(Sulfolobus)是一种极端嗜热古菌,其最适生长温度为80℃,最适生长pH为3左右,基因组DNA被认为呈松弛状态或略带正超螺旋.该文通过Q Sepharose、Heparin柱层析,结合SDS
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硫化叶菌(Sulfolobus)是一种极端嗜热古菌,其最适生长温度为80℃,最适生长pH为3左右,基因组DNA被认为呈松弛状态或略带正超螺旋.该文通过Q Sepharose、Heparin柱层析,结合SDS-PAGE纯化、变性、复性等步骤,从芝田硫化叶菌(S.shibatae)中分离纯化了一种反旋转酶.SDS-PAGE显示,纯化的反旋转酶分子量为126kDa,在Mg<2+>或Ca<2+>存在的情况下,可利用ATP水解的能量在低盐浓度下(10mM NaCl)向DNA分子中引入正超螺旋.N-未端序列及同源性搜索发现,该酶的编码基因为topR1,而非先前从该菌中克隆得到的topR基因.拓扑异构酶Ⅰ是在细菌、古菌和真核生物中普遍存在的一种拓扑异构酶.已完成全序列测定的硫磺矿硫化叶菌(S.solfataricus)编码一个推测的拓扑异构酶Ⅰ(Sso Topo Ⅰ).该文克隆并在大肠杆菌中表达了编码Sso Topo Ⅰ的基因,采用一个包括热处理的简单纯化程序纯化了重组蛋白.活性分析表明,重组蛋白能够松弛负超螺旋DNA,因此是拓扑异构酶Ⅰ.定点突变实验证实318位的酪氨酸是该酶的活性位点,突变酶(Y318F)完全丧失了负超螺旋松弛活性和寡核苷酸切割能力.Sso Topo Ⅰ不能松弛正超螺旋DNA,其负超螺旋DNA松弛活性不依赖ATP的存在,但依赖于于二价阳离子(Mg<2+>或Ca<2+>).该酶的最适pH为7.5-9.0,最适反应温度为75℃,该酶具有较高的热稳定性,85℃保温3小时后,酶活只是略有降低.该酶的作用模式受盐浓度的影响,在低盐浓度下(50mM)为行进式,而在高盐浓度下(200mM)为分布式.在标准的实验条件下,该酶表现出很高的负超螺旋松弛活性,40fmol的酶在30分钟内就可以完全松弛300ng负超螺旋pUC18质粒.对大肠杆菌Topo Ⅰ有抑制作用的化学物质-亚精胺,可明显促进该酶的活性.
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