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正相色谱(NPC)是一种经典的液相色谱,分离量大、效率高、原料廉价易得,因而被广泛应用于有机合成及植物化学等常规分离。其采用极性填料做固定相,相对非极性有机溶剂作流动相,与极性化合物作用力强,所以正相色谱系统一般适用于极性化合物的分离,极性小的组分先流出。然而,在样品纯化过程中,不能仅看分离度,还要考虑分离量、样品溶解性、分离时间以及不可逆吸附等因素。实际上,正相色谱更适用于低极性化合物的制备性分离。本文中将常压硅胶柱色谱与正相快速色谱(NPFC)相结合,建立天然产物中低极性化合物快速分离方案,以青木香、木香、土木香以及芫花为研究对象,具体研究内容如下:
(一)青木香甲醇粗提物经石油醚萃取、浓缩后得浸膏。取浸膏35 g进行制备,石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱。经过一步NPFC分离以及加石油醚重结晶,制备出4.2 g马兜铃酮,HPLC纯度为99.7%。
(二)木香甲醇粗提物经石油醚萃取、浓缩后得浸膏。取浸膏100 g进行常压硅胶柱层析,石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱。将目标物流分进行合并、浓缩,所得浸膏经冷冻后得到淡黄色晶体15 g和红棕色油19.5 g。各取3 g红棕色油以及3 g淡黄色晶体进行制备,石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱,最后用甲醇冲柱。经过一步NPFC分离以及加正庚烷重结晶,3 g红棕色油制备出1.01 g木香烃内酯和1.4 g去氢木香内酯,HPLC纯度分别为99.6%和99.9%;3 g淡黄色晶体制备出0.38 g木香烃内酯和1.94 g去氢木香内酯,HPLC纯度分别为99.8%和100%。
(三)土木香甲醇粗提物经石油醚萃取、浓缩后得浸膏。浸膏冷冻后得到黄色固体和黄色油。黄色固体加石油醚搅拌后抽滤,得白色固体。取白色固体30 g进行常压硅胶柱层析,石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱。经过一步常压硅胶柱层析,制备出异土木香内酯18 g,HPLC纯度为99.3%;取黄色油100 g进行常压硅胶柱层析,石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱。将目标物流分进行合并、浓缩,得淡黄色固体33 g。取淡黄色固体10 g进行制备,石油醚-甲苯-乙酸乙酯等度洗脱。经过一步AgNO3硅胶柱层析,制备出土木香内酯3g、异土木香内酯5 g,HPLC纯度分别为99.4%和99.2%。
(四)芫花(第一批)甲醇提取得浸膏。取浸膏210 g进行NPFC分离,制备过程中开始为石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱,后改为二氯甲烷-丙酮梯度洗脱。经过一步NPFC分离以及加二氯甲烷超声后抽滤,得黄绿色固体1.4 g。重复此过程,从5400 g浸膏中制备出黄绿色固体,芫花素HPLC纯度为58.1%。往该黄绿色固体中加饱和Na2CO3溶液,水浴70℃搅拌1h后抽滤,得黄色固体,继续加甲醇煮沸,最后33 g黄绿色固体制备出芫花素15g,HPLC纯度为98.6%。
芫花(第二批)甲醇粗提物加石油醚萃取除去油脂,继续加氯仿萃取得氯仿层以及上层不溶物,氯仿层浓缩后得黑色浸膏280 g,上层不溶物经离心、真空冷冻干燥得黄色固体226 g。取黄色固体100 g进行NPFC分离,制备过程中为环己烷-丙酮等度洗脱,最后用甲醇冲柱。经过一步NPFC分离得黄色固体,继续加石油醚搅拌后抽滤,得芫花素1.5 g,HPLC纯度98.6%;取黑色浸膏280 g进行NPFC分离,制备过程中为环己烷-丙酮等度洗脱,最后用甲醇冲柱。经过一步NPFC分离得黄绿色固体,继续加二氯甲烷超声,甲醇煮沸、冷却后抽滤,得芫花素1.35 g,HPLC纯度为98.3%。