鸡传染性贫血病（Chickeninfectious anemia,CIA）是由鸡传染性贫血病毒（Chicken infectious anemia virus,CIAV）感染引起的雏鸡以再生障碍性贫血和全身性淋巴组织萎缩为特征的一种免疫抑制性疾病。临床上,该病毒可以感染所有年龄的鸡群,既可垂直传播,也可水平传播,且传染性强,使整个鸡群生产力下降,死亡率增加,对家禽养殖业造成了严重的经济损失。然目前,CIAV感染雏鸡引起免疫抑制的细胞机制研究尚浅,对CIAV与易感细胞互作的分子基础尚不清楚,国内也无自主产权的检测CIAV抗体技术。因此,本研究靶向CIAV的衣壳蛋白VP1蛋白,以感染表达VP1蛋白保守B细胞表位的杆状病毒的细胞为抗原,建立了一种检测CIAV抗体的间接免疫荧光（IFA）方法。同时,利用免疫共沉淀（Co-IP）、银染及质谱等技术初步鉴定出了与VP1蛋白互作的几个细胞蛋白。本研究为CIA的免疫防控提供了抗体检测技术,也为进一步探究CIAV感染分子机理提供了新靶点。1 CIAV-VP1蛋白25-45aa表位在杆状病毒表达系统中的表达课题组前期利用多肽合成技术研究发现,CIAV-VP125-45aa多肽可与CIAV阳性血清进行有效反应。为了获得表达CIAV-VP125-45aa多肽表位的重组杆状病毒,本研究首先将多肽序列VP125-45aa进行了 3拷贝串联,克隆到pFastBac-HTA载体成功构建转移载体pFastBac-HTA-3VP125-45aa,随即转座到DH10Bac感受态细胞中,获得重组杆状病毒质粒rBacmid-3VP125-45aa,最后利用脂质体LipofectamineTM 3000转染Sf9细胞获得重组杆状病毒rBac-3VP125-45aa。IFA实验进一步证明,获得的重组杆状病毒rBac-3VP125-45aa能很好的表达VP125-45aa表位,能被CIAV-VP1-1C5单克隆抗体以及CIAV阳性鸡血清特异性识别,而与对应的阴性血清不反应。表达VP125-45aa表位的重组杆状病毒的成功构建为下一步建立检测CIAV抗体的IFA方法提供了抗原,打下了基础。2检测CIAV抗体的间接免疫荧光方法的建立及初步应用为了建立一种能够快捷特异检测CIAV的抗体方法,本研究以表达VP125-45aa表位的重组杆状病毒rBac-3VP125-45aa感染的Sf9细胞为抗原,建立了检测CIAV抗体的间接免疫荧光（IFA）技术。通过优化IFA实验中的各项条件,确定了制备抗原细胞板最佳感染剂量为0.4MOI,最佳感染天数为7天,一抗中的鸡血清最佳稀释比例为1:20。特异性检测发现,感染重组杆状病毒rBac-3VP125-45aa的Sf9细胞仅与VP1的单抗以及CIAV阳性多抗血清发生特异性反应,而与所检测的REV、AIV-H9、IBV、NDV以及ALV-J等阳性多抗血清均无特异性反应。同时,与实验室自制的pELISA以及商品化的IDEXX的ELISA试剂盒对临床鸡血清进行了比对研究,结果发现IFA与多肽pELISA和IDEXX试剂盒检测结果总符合率分别为94%和88%。因此,本研究建立的检测CIAV抗体的间接免疫荧光方法为CIAV免疫防控提供了一种便捷的血清学检测技术。3 CIAV-VP1蛋白互作细胞蛋白的初步鉴定为了鉴定介导CIAV感染的细胞受体,本研究靶向衣壳蛋白VP1,利用LMH细胞以及VP1的单抗CIAV-VP1-2E3,通过转染pcDNA3.1-VP1质粒、Co-IP、银染以及质谱分析鉴定与VP1蛋白互作的细胞蛋白。质谱结果筛选出5个疑似互作蛋白ATP2A2、SLC25A13、HSPA8、MATR3及FAM49B。在克隆表达以上5个疑似互作蛋白的基础上,通过Co-IP以及Western-blot进行验证,结果显示ATP2A2、SLC25A13、HSPA8以及FAM49B能与VP1发生有效互作。将互作蛋白分别转染LMH中评价对CIAV感染与复制的影响,结果发现FAM49B可促进CIAV感染与复制,而其余3个互作蛋白对CIAV复制影响不明显。本研究中VP1互作蛋白的筛选,克隆表达及其对CIAV感染复制的影响的探究为下一步鉴定介导CIAV感染的细胞受体、明确CIAV感染的分子机制提供了新靶标。