【摘 要】
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目的 循环肿瘤DNA（Circulating tumorDNA,ctDNA）是肿瘤细胞释放到血浆中的游离DNA分子,携带有肿瘤的遗传变异信息,如单核苷酸变异、染色体拷贝数变异、DNA甲基化等。ctDNA的半衰期很短,血浆中的ctDNA浓度可以实时反映肿瘤的动态变化。根据查阅的文献资料和COSMIC数据库,筛选出21个与肝细胞肝癌发生具有较高相关性的驱动突变基因,覆盖126个检测区域,组成突变检测p
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目的 循环肿瘤DNA（Circulating tumorDNA,ctDNA）是肿瘤细胞释放到血浆中的游离DNA分子,携带有肿瘤的遗传变异信息,如单核苷酸变异、染色体拷贝数变异、DNA甲基化等。ctDNA的半衰期很短,血浆中的ctDNA浓度可以实时反映肿瘤的动态变化。根据查阅的文献资料和COSMIC数据库,筛选出21个与肝细胞肝癌发生具有较高相关性的驱动突变基因,覆盖126个检测区域,组成突变检测panel。本研究拟探索该突变检测panel在肝细胞肝癌早期筛查中的潜在应用价值。方法 1通过文献资料和COSMIC数据库联合分析,筛选与肝细胞肝癌发生具有较高相关性的突变基因及突变位点,组成突变检测panel。2利用Primer 6.0设计检测目标区域的引物,并通过普通PCR反应、多重PCR反应和NGS进行panel的优化。3收集临床样本,血浆处理后提取ctDNA。4使用建库试剂盒进行文库构建。5利用NGS的Ion torrent测序平台对建库产物进行测序。6利用生物信息学分析样本在突变检测区域的突变情况以及实验组和对照组样本检测到的突变位点差异。结果 1构建了一个含有21个与肝细胞肝癌发生具有较高相关性的驱动突变基因、同时覆盖126个检测区域的突变检测panel,并优化突变检测体系,获得能够上机测序的突变检测panel。2使用突变检测panel检测20例HCC患者、20例HBV/肝硬化患者和11例健康人,完成临床验证。3在51例临床样本中检测到34个目标区域突变,其中11个突变位于内含子区域,23个突变位于外显子区域。对比COSMIC数据库,新发现16个目标区域外显子突变。4分析突变位点在实验组和对照组样本中的分布,发现9个目标区域外显子突变仅在HCC患者中被检出,3个目标区域外显子突变在HCC患者和HBV/肝硬化患者中被检出。结论 循环肿瘤DNA突变在HCC早期筛查中具有潜在的应用价值,其中基因KRAS（chr12:25380314和chr12:25378557）、ARID2（chr12:46231370、chr12:46233127和chr12:46244974）、NRAS（chr1:115258743）、AXIN1（chr16:396428和chr16:347887）、PIK3CA（chr3:178916862）和TP53（chr17:7577534、chr17:7579415和chr17:7579885）可能应用于HCC早期筛查,需要进一步扩大样本量进行临床验证。另外,除NRAS（chr1:115258743）、AXIN1（chr16:347887）、ARID2（chr12:46244974）和TP53（chr17:7579415、chr17:7577534和chr17:7579885）六个位点外,剩余位点需要进一步优化引物扩增效率,以排除假阳性突变。
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