论文部分内容阅读
目的:本实验以油酸(OA)胶束与鸡蛋清溶菌酶(HEWL)为模拟分子,解析淀粉样蛋白的聚集机制,并比较不同浓度OA胶束以及OAHEWL聚合体对SH-SY5Y细胞和神经干细胞(NSCs)的生物学效应,初步探讨OA胶束对淀粉样蛋白斑块形成的影响,进一步提高对阿尔兹海默症(AD)病理机制的认识。方法:为了保持OA胶束构象,所有样品都在800 rpm、pH 2.3和57℃条件下持续摇动;实验运用原子力显微镜(AFM)、ThT结合法、CD光谱法对淀粉样蛋白的纤维化过程进行初步表征。AFM是研究蛋白质聚集过程中动态变化的重要实验手段,可观察在不同条件下形成的淀粉样蛋白寡聚体、原纤维和纤维的形态结构并测量各结构的高度;采用ThT结合法监测蛋白质纤维化的动力学过程;运用CD光谱法分析蛋白纤维化过程中蛋白质二级结构变化。采用WST-1法和荧光显微镜连续成像法观察不同浓度OA胶束以及不同浓度OA-HEWL聚合体对SH-SY5Y细胞和NSCs的活性影响。结果:AFM结果显示,与对照组相比,OA100组形成大量的圆形寡聚体,这些寡聚体进一步结合形成纤维状结构,纤维高度最高可达60nm。ThT荧光染料可与蛋白质中的β-折叠结构特异性结合,用FluoroMax-2分光光度计测试蛋白样品的ThT荧光强度,结果发现HEWL组、OA10组、OA100组在50h前,OA100组ThT荧光强度最高,但增长率较缓;50h后,HEWL组增长速度最快,ThT荧光强度持续增高,高于OA10组和OA100组,而OA100组荧光强度最低。CD光谱结果显示,10h时,HEWL组、OA10组、OA100组所得曲线在208nm处有一最低负峰,此与α-螺旋结构的特征峰类似,而在7d时,在217nm处有一最低负峰,与β-折叠结构的特征峰一致。WST-1法和荧光显微镜结果显示,与对照组相比,在OA浓度为140μM时,OA对SH-SY5Y细胞和NSCs具有明显的增殖抑制作用(P<0.01),而当OA与HEWL共孵育后,OA-HEWL对细胞的毒性明显减弱。结论:OA胶束与HEWL共孵育后可以促进类淀粉样蛋白板块的形成,并能显著降低OA对SH-SY5Y细胞和NSCs的毒性作用。目的:通过提取高纯度的S100A9蛋白和构建核转录因κB(NF-κB)p65基因过表达慢病毒载体并转染体外培养的SH-SY5Y细胞,观察S100A9介导的NF-κB(p65)入核动态变化对SH-SY5Y细胞系的生物学效应。方法:利用前期实验成功构建的原核表达质粒p ET28aS100A9,提取并转化质粒;使用IPTG诱导S100A9蛋白表达;采用SDS-PAGE和WB对S100A9蛋白进行验证;采用镍亲和柱分离并纯化蛋白;透析、浓缩并低温冻干获得蛋白粉;利用PCR方法获取目的基因片段RELA(p65),并构建慢病毒载体;琼脂糖凝胶电泳鉴定成功后用构建好的慢病毒载体转染293T细胞;以最适的MOI感染SHSY5Y细胞,并筛选SH-SY5Y稳转株;运用荧光显微镜和流式细胞术检测病毒转染效率;采用CCK-8法检测S100A9蛋白对SH-SY5Y稳转株活性的影响;运用Matlab(R2017a)分析软件分析S100A9蛋白对SH-SY5Y稳转株细胞核内外p65表达量的影响。结果:SDS-PAGE和WB证明成功获取了高纯度蛋白。琼脂糖凝胶电泳显示成功构建p65基因过表达的慢病毒载体;CCK-8结果显示S100A9对SH-SY5Y细胞具有明显增殖抑制作用(P<0.05),且p65-GFP组的抑制作用没有对照组和空载组强,对照组和空载组二者无显著性差异;荧光显微镜和流式细胞结果显示构建的SH-SY5Y稳转株转染率约达90%,SH-SY5Y稳转株构建成功。Matlab分析结果显示S100A9蛋白可以激活NF-κB信号通路,引起p65入核,且入核与阳性对照TNF-α刺激NF-κB入核存在差异。结论:S100A9促进SH-SY5Y细胞增殖抑制可能是激活了NF-κB信号通路。