由条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis f.sp.tritici)引起的条锈病是小麦生产上的一种重要真菌病害。目前生产上主要利用抗病品种来防治小麦条锈病。但是小麦抗病品种容易随着条锈菌致病性的不断变异而丧失抗性,导致条锈病持续威胁着全球小麦生产和粮食安全。因此解析小麦条锈菌的致病及其变异机制对开发新的持久防治条锈病策略具有重要意义。本论文在小麦条锈菌全基因组测序基础上,对致病效应基因(Effector gene)和细胞信号转导中的Ras和激酶基因开展研究,明确它们在病菌侵染致病中的作用。该研究为全面揭示小麦条锈菌的致病机理奠定基础,进而为小麦条锈病的持久控制新策略的制定提供重要的理论依据。主要研究结果如下:1.效应基因的鉴定与功能解析借助农杆菌介导的PVX病毒表达系统,在模式植物本氏烟中高通量表达了26个小麦条锈菌候选效应基因,从中鉴定到了6个能够抑制BAX诱导PCD的条锈菌效应基因。通过酵母分泌系统证实了这6个效应基因编码的蛋白(效应蛋白)均为典型的分泌蛋白。q RT-PCR分析发现其中的4个效应基因(Ps4884、Ps4941、Ps5278和Ps5578)在条锈菌侵染小麦过程中诱导表达,而Ps4593和Ps5086则在其侵染过程中下调表达。小麦条锈菌效应基因呈现不同的表达模式暗示它们可能在不同侵染时期发挥功能。利用细菌III型分泌系统将这6个条锈菌效应基因在其寄主小麦中进行瞬时表达,从而明确了它们的毒性和无毒性功能。结果表明除Ps4593之外的5个效应基因均能抑制非病原细菌激发的小麦PTI防卫反应,且所有的6个效应基因均能抑制小麦与无毒性条锈菌菌系互作中的ETI反应。这表明鉴定到的小麦条锈菌效应基因具有显著的毒性功能。另一方面,通过大规模筛选发现Ps4884、Ps4941和Ps5578这三个不同的效应基因均能在Yr1近等基因系的小麦材料上诱导过敏性反应(HR)类似细胞坏死,而Ps4941同时还能在Yr7近等基因系的小麦材料上诱导HR类似细胞坏死。这些结果表明Ps4884、Ps4941和Ps5578为候选的条锈菌无毒基因,也揭示了多个条锈菌无毒基因可与同一个小麦抗病基因识别,而单个条锈菌无毒基因也可与多个小麦抗病基因识别。在烟草中对这6个小麦条锈菌效应蛋白进行亚细胞定位,发现它们均位于烟草细胞内,属于典型的胞内效应蛋白。同时大豆根部吸收实验发现小麦条锈菌效应蛋白与GFP的融合蛋白在没有病原菌介导的情况下能够进入大豆的根尖细胞,这表明了小麦条锈菌效应蛋白可不依赖于病原菌的存在而转运进入寄主细胞内。序列分析发现这6个效应蛋白均不含卵菌效应蛋白中负责转运的RXLR基序,推测小麦条锈菌效应蛋白与卵菌效应蛋白具有不同的转运方式。禾谷类白粉菌中预测的Y/F/Wx C基序在其中的4个小麦条锈菌效应蛋白存在,然而该基序的突变体并不能改变其小麦条锈菌效应蛋白在烟草中的亚细胞定位和抑制BAX诱导PCD的毒性功能。这表明Y/F/Wx C基序并不负责小麦条锈菌效应蛋白的转运和毒性功能。2.关键效应基因的靶标鉴定在之前鉴定得到的6个小麦条锈菌效应基因中,我们选取了两个关键的效应基因进行毒性机制研究。Ps KE1(Ps5578)和Ps KE2(Ps4941)具有相似的转录表达水平和毒性功能。分析发现它们虽然在蛋白序列上具有较低的相似性,但在蛋白的一级结构上具有较高的相似性。利用寄主诱导的基因沉默(HIGS)技术将它们沉默后会导致条锈菌在寄主小麦上的致病表型减弱。组织学观察发现沉默植株中条锈菌的菌丝发育受到抑制,同时寄主植物的防卫反应增强。这些结果表明Ps KE1和Ps KE2很可能通过抑制植物的防卫反应来参与条锈菌在小麦上的毒性。利用酵母双杂的方法,筛选到三个来自不同家族的小麦靶标蛋白与Ps KE1蛋白进行互作,分别为Ta PKDM7-1、Ta Trx-m4和Ta DHN-1。同时Ta PKDM7-1和Ta Trx-m4也能与Ps KE2蛋白进行互作。进一步的酵母双杂实验表明Ps KE1不能与Ps KE2互作,而这三个小麦靶标蛋白之间也无明显的互作。对效应蛋白和靶标蛋白在小麦原生质体中进行亚细胞定位,发现Ps KE1和Ps KE2均定位于细胞质和细胞核中,而Ta PKDM7-1、Ta Trx-m4和Ta DHN-1也分别定位于细胞核、细胞质、细胞质和细胞核中。这些结果证实了这两个条锈菌效应蛋白与其小麦靶标蛋白在细胞质和/或细胞核中进行互作的可能性。而双分子荧光互补(BIFC)实验证明了这两个条锈菌效应蛋白与其小麦靶标蛋白确实能在植物体内互作。q RT-PCR分析发现这三个小麦靶标基因均受条锈菌侵染诱导表达,且表达高峰期与Ps KE1和Ps KE2的高峰期一致。利用病毒介导的基因沉默(VIGS)技术沉默这三个小麦靶标后导致条锈菌致病表型减弱。组织学观察发现沉默植株中的条锈菌菌丝发育受到抑制,同时其寄主防卫反应增强。这些结果表明这三个小麦靶标基因很可能通过抑制植物的防卫反应来参与小麦对条锈菌的感病性。3.明确两个不同Ras基因在致病性和细胞程序性死亡中的分化功能在小麦条锈菌基因组鉴定了两个不同的Ras基因,Ps Ras1和Ps Ras2。系统发育分析发现小麦条锈菌的两个Ras基因属于两个不同的进化分支。和其它丝状真菌的Ras2蛋白相比,禾谷类锈菌和同属担子菌的玉米瘤黑粉菌的Ras2蛋白有明显的序列缺失。q RT-PCR分析发现Ps Ras1和Ps Ras2具有不同的转录表达特征,分别在条锈菌侵染小麦过程中下调和上调表达。利用HIGS技术分别将Ps Ras1和Ps Ras2进行沉默,结果发现Ps Ras1和Ps Ras2沉默植株的吸器数目都减少,然而侵染菌丝的长度只在Ps Ras2沉默植株上变短,在Ps Ras1沉默植株上无明显变化。最终的致病表型也只在Ps Ras2沉默植株上减弱,在Ps Ras1沉默植株上无明显变化。这表明与Ps Ras1相比,Ps Ras2在条锈菌的致病性中起着更加重要的作用。然而将条锈菌Ras基因与小麦赤霉菌ras2突变体进行互补实验发现,Ps Ras2并不能恢复赤霉菌ras2突变体在菌丝生长方面的缺陷。这表明小麦条锈菌和赤霉菌的Ras2基因在功能上的差异性。Ps Ras1虽在小麦条锈菌的致病性中起着较小的作用,但将其在植物系统中瞬时表达后能够引起植物的细胞程序性死亡(PCD),Ps Ras2则不能。进一步发现,Ps Ras1蛋白中所有Ras蛋白保守结构域均负责PCD的诱导。同时Ps Ras1诱导的植物PCD表现出和植物HR类似的细胞学特征,并依赖于植物的一个MAPK级联途径,该MAPK级联途径已知也参与了植物HR。这些结果表明Ps Ras1诱导的植物PCD和植物HR具有类似的机制。4.禾谷类锈菌特有激酶基因Ps SRPKL是小麦条锈菌重要的致病因子在小麦条锈菌吸器库中鉴定到了一个新颖的激酶基因Ps SRPKL。q RT-PCR分析发现Ps SRPKL在条锈菌侵染小麦过程中高量诱导表达,同时也在侵染转主寄主小檗中诱导表达。系统发育分析发现Ps SRPKL属于禾谷类锈菌进化上特有的激酶基因。进一步研究发现Ps SRPKL具有高水平的种内序列多态性,且突变氨基酸集中于其激酶结构域。同时在烟草和拟南芥中的亚细胞定位实验均发现Ps SRPKL定位于细胞核。在裂殖酵母中过表达Ps SRPKL后会引起酵母细胞的形态畸形,同时降低酵母细胞对环境胁迫(包括氧胁迫和高渗胁迫)的抗性。利用HIGS技术将Ps SRPKL进行沉默,结果发现Ps SRPKL沉默植株的条锈菌致病表型减弱。组织学观察发现沉默植株中的条锈菌的菌丝发育受到抑制,同时寄主植物的活性氧积累增加。这些结果表明Ps SRPKL是一个重要的条锈菌致病因子,通过调控菌丝发育和环境胁迫抗性来参与条锈菌在小麦上的致病性。