【摘 要】
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目的:脉络膜黑色素瘤是成人眼内发病率最高的恶性肿瘤,预后较差,现有治疗手段效果不佳。本研究旨在探究亚精胺合成酶（Spermidine synthase,SRM）在脉络膜黑色素瘤中的调控作用及其上游调控因子miR-423-5p通过抑制SRM转录后表达对脉络膜黑色素瘤细胞增殖的影响。这些研究结果可为脉络膜黑色素瘤的治疗提供新靶点。方法:1、探究SRM表达量与脉络膜黑色素瘤患者生存率间的关系通过数据库G
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目的:脉络膜黑色素瘤是成人眼内发病率最高的恶性肿瘤,预后较差,现有治疗手段效果不佳。本研究旨在探究亚精胺合成酶（Spermidine synthase,SRM）在脉络膜黑色素瘤中的调控作用及其上游调控因子miR-423-5p通过抑制SRM转录后表达对脉络膜黑色素瘤细胞增殖的影响。这些研究结果可为脉络膜黑色素瘤的治疗提供新靶点。方法:1、探究SRM表达量与脉络膜黑色素瘤患者生存率间的关系通过数据库GEPIA2统计分析SRM表达量与脉络膜黑色素瘤患者生存率之间的关系。2、探究SRM对脉络膜黑色素瘤细胞增殖能力的影响体外培养人眼侵袭性脉络膜黑色素瘤细胞MUM-2B及人眼脉络膜黑色素瘤细胞OCM-1,运用重组慢病毒技术稳定转染敲减序列（sh-SRM）和对照序列（shnc）,q RT-PCR技术检测SRM m RNA表达变化;Western Blot检测SRM蛋白表达变化;CCK-8实验检测细胞生存能力变化;EDU实验检测细胞增殖能力变化。通过裸鼠成瘤实验检测敲减SRM在体内环境下对脉络膜黑色素瘤细胞增殖能力的影响。3、探究miR-423-5p靶向SRM并调控其表达利用生物信息学网站Targetscan、miRDB及miRTar Base预测与SRM m RNA3’UTR区结合的miRNA,双荧光素酶报告实验验证miR-423-5p与SRM m RNA 3’UTR区结合情况。瞬时转染miR-423-5p模拟物序列（mimics）及对照序列（mimic nc）,q RT-PCR技术检测miR-423-5p及SRM m RNA表达变化;Western Blot检测SRM蛋白表达变化。4、探究miR-423-5p对脉络膜黑色素瘤细胞增殖能力的影响瞬时转染miR-423-5p mimics及mimic nc,CCK-8实验检测细胞生存能力变化;EDU实验检测细胞增殖能力变化。5、探究mir-423-5p靶向SRM对脉络膜黑色素瘤细胞增殖能力的影响构建SRM过表达稳定转染细胞系,Western Blot检测SRM蛋白表达变化。同时转染miR-423-5p mimics及mimic nc,Western Blot检测SRM蛋白表达变化;CCK-8实验检测细胞生存能力变化;EDU实验检测细胞增殖能力变化。结果:1、数据库GEPIA2统计分析显示,SRM表达量较低的患者有较好的生存率。2、q RT-PCR结果显示,与shnc组相比,sh-SRM组SRM m RNA表达下调;Western Blot结果显示,与shnc组相比,sh-SRM组SRM蛋白表达量下调;EDU实验结果显示,与shnc组相比,sh-SRM组细胞增殖能力下降;CCK-8实验结果显示,与shnc组相比,sh-SRM组细胞生存能力降低。裸鼠皮下成瘤实验结果显示,shSRM组肿瘤重量低于shnc组。3、生物信息学网站预测结果,miR-423-5p与SRM m RNA 3’UTR区存在互补序列。双荧光素酶报告实验结果显示,miR-423-5p mimics+WT组的荧光素酶活性明显降低。q RT-PCR结果显示,与mimic nc组相比,miR-423-5p mimics组miR-423-5p表达上调及SRM m RNA表达下调;Western Blot结果显示,与mimic nc组相比,miR-423-5p mimics组SRM蛋白表达下调。4、CCK-8实验结果显示,与mimic nc组相比,miR-423-5p mimics组细胞生存能力降低;EDU实验结果显示,与mimic nc组相比,miR-423-5p mimics组细胞增殖能力下降。5、Western Blot结果显示,与对照组（Vector）相比,SRM过表达组（SRMOE）SRM蛋白表达上调;同时转染miR-423-5p mimics及mimic nc,与mimic nc+SRM-OE组相比,miR-423-5p mimics+SRM-OE组细胞增殖能力下降,细胞生存能力降低。结论:1、敲减SRM能够抑制脉络膜黑色素瘤细胞增殖;2、miR-423-5p靶向SRM m RNA 3’UTR区并抑制转录后表达;3、miR-423-5p靶向SRM抑制脉络膜黑色素瘤细胞增殖。
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