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目的食管癌(Esophageal Cancer,EC)是常见的上消化道肿瘤。我国是世界上食管癌高发区之一,主要高发省份为河北、河南、福建和重庆,尤其在河北省磁县、河南省林州发病率和死亡率较高。食管癌的发生发展是一个长期的过程,食管癌的发生经历了食管鳞状上皮细胞轻、中度不典型增生,重度不典型增生到原位癌、食管鳞状细胞癌的过程。轻中度不典型增生是重度不典型增生之前的一个阶段,具有双向不稳定性,如对此阶段进行药物干预,阻止其向重度不典型增生及原位癌阶段发展,则能够达到预防食管鳞癌发生的目的。研究发现,细胞内信号转导通路(Wnt、Notch、Ras/Raf/MEK/ERK、PI3K/Akt/m TOR)的激活对食管癌的发生、发展起到重要的作用。因此,针对信号通路中特定信号分子靶向作用可能为食管癌预防和治疗的新方法。冬凌草为唇形科香茶菜属植物,民间主要用来治疗咽喉肿痛、虫蛇咬伤和防治食管癌,冬凌草甲素为其主要抗肿瘤成分之一。临床实验证明,冬凌草能够明显缓解肿瘤症状,如食管癌、贲门癌、原发性肝癌和乳腺癌等,能够稳定和缩小肿瘤体积并且能够延长患者生命,对其抗肿瘤机制多集中于对肿瘤细胞的杀伤作用、诱导肿瘤细胞凋亡、增强其他抗肿瘤药物疗效等方面。但该化合物对食管早期轻中度不典型增生是否有抑制作用并在食管癌的化学预防中发挥作用并不清楚。本研究以表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)诱导食管上皮细胞转化为模型,探索冬凌草甲素对食管上皮细胞转化的抑制作用及其相应分子机制,以期为早期食管癌化学预防提供依据。材料与方法1.SHEE细胞毒性实验:检测不同浓度(DMSO、1、5、10、25、50和100μM)的冬凌草甲素对SHEE细胞的毒性作用,筛选出细胞增殖抑制实验的药物浓度。2.SHEE细胞的增殖抑制实验:根据细胞毒性实验结果筛选出的最大药物浓度为20μM,设置细胞增殖抑制实验药物浓度(DMSO、1、2.5、5、10和20μM),检测不同浓度冬凌草甲素在不同时间点(0h、24h、48h、72h和96h)对SHEE细胞的增殖抑制作用。3.软琼脂克隆形成实验:观察不同浓度(DMSO、EGF、1μM+EGF、2.5μM+EGF、5μM+EGF、10μM+EGF和20μM+EGF,EGF浓度为10ng/ml)的冬凌草甲素对EGF诱导的SHEE细胞转化能力的影响。4.磷酸蛋白激酶芯片检测:用DMSO、EGF(10ng/ml)、冬凌草甲素(20μM)+EGF(10ng/ml)处理细胞,通过磷酸蛋白激酶芯片,筛选出冬凌草甲素能够抑制EGF诱导的蛋白激酶。5.蛋白印迹实验:验证磷酸蛋白激酶芯片结果,确定冬凌草甲素抑制EGF诱导的磷酸蛋白激酶。6.对细胞信号通路EGFR/Akt/GSK-3β、EGFR/Akt/m TOR和EGFR/ERK/RSK的检测:通过药物浓度梯度蛋白印迹实验,探究不同浓度冬凌草甲素(DMSO、EGF、1μM+EGF、2.5μM+EGF、5μM+EGF、10μM+EGF和20μM+EGF,EGF浓度为10ng/ml)对EGF诱导的蛋白激酶磷酸化的抑制作用,并且和已知PI3K抑制剂LY294002的抑制作用进行对比。结果1.不同浓度(DMSO、1、5、10、25、50和100μM)的冬凌草甲素分别作用于SHEE细胞24和48 h,CCK-8法测定OD值,以实验组/对照组的比值为纵坐标,冬凌草甲素的浓度为横坐标作出细胞生存率曲线,得出冬凌草甲素对SHEE细胞80%存活率约为20μM。2.不同浓度(DMSO、1、2.5、5、10和20μM)的冬凌草甲素分别作用于SHEE细胞0h、24h、48h、72h和96h,CCK-8法测定OD值,以吸光度为纵坐标,时间为横坐标作出不同药物浓度的细胞增殖曲线,发现较低剂量冬凌草甲素和短时间处理对SHEE细胞并没有明显的增殖抑制作用,20μM浓度的冬凌草甲素作用72h和96h后能够抑制SHEE细胞的增殖(P<0.05)。3.不同浓度(DMSO、EGF、1μM+EGF、2.5μM+EGF、5μM+EGF、10μM+EGF和20μM+EGF,EGF浓度为10ng/ml)的冬凌草甲素软琼脂克隆形成实验,DMSO组细胞没有转化,处于单个分散状态,EGF组细胞转化能力强且克隆数量多,冬凌草甲素组随着浓度的增高细胞转化能力降低且克隆数量变少(P<0.05)。4.蛋白芯片通过计算灰度值显示出结果,发现冬凌草甲素能够抑制Akt/m TOR和Akt/GSK3β的磷酸化,冬凌草甲素对EGF诱导的ERK/RSK信号通路磷酸化水平没有抑制作用。5.蛋白印迹实验结果和芯片结果保持一致。6.药物浓度梯度蛋白印迹实验结果发现,冬凌草甲素对EGF诱导的Akt/m TOR和Akt/GSK3β磷酸化的抑制作用呈现浓度依赖性(P<0.05),和PI3K抑制剂LY294002相比,没有统计学差异(P>0.05)。结论:1.冬凌草甲素可抑制食管上皮细胞SHEE的增殖,并且能够抑制EGF诱导的SHEE细胞转化。2.冬凌草甲素能够抑制EGF诱导Akt的磷酸化,进而抑制其下游m TOR、GSK3β的磷酸化。但对EGF诱导ERK和其下游RSK2的磷酸化没有抑制。