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“Dolly”诞生以来，体细胞核移植技术得到了快速的发展，各种克隆动物相继诞生。但是，体细胞核移植胚胎体外发育率低，受孕率低，流产率高及克隆动物出生后异常成为制约这项技术广泛应用的瓶颈。目前研究认为体细胞核在卵母细胞质中不完全的表观遗传重编程是引起克隆胚胎及克隆动物发育异常，核移植效率低下的重要原因。为了进一步研究胚胎早期发育过程中的表观遗传重编程机制，提高核移植效率，本研究对牛卵母细胞体外成熟过程，体外受精胚胎和体细胞核移植胚胎早期发育过程中几个重要的表观遗传修饰位点进行检测，较系统地研究了牛卵母细胞体外成熟和胚胎早期发育过程中表观遗传修饰的变化，并比较了牛体细胞核移植胚胎和体外受精胚胎早期发育过程中表观遗传修饰的差异；研究了不同的组蛋白去乙酰化酶抑制剂对牛体细胞核移植胚胎体外发育能力和表观遗传重编程的影响；建立了牛卵母细胞Cell-Free体系，并利用该体系对体细胞重编程因子进行了初步筛选。主要的研究内容和结果如下：1.采用免疫荧光染色技术，对牛卵母细胞体外成熟过程，体外受精胚胎和体细胞核移植胚胎早期发育过程中几个重要的表观遗传修饰位点（5-mec， H3K9ac，H4K8ac，H3K9m2和H3K9m3）进行检测。结果显示，在牛卵母细胞成熟过程中，组蛋白H3K9位点和H4K8位点发生去乙酰化，组蛋白H3K9二甲基化位点发生去甲基化，组蛋白H3K9三甲基化和DNA甲基化信号稳定表达；在牛体外受精胚胎早期发育过程中，5-mec位点发生去甲基化，8细胞后重新甲基化，组蛋白H3K9位点发生去乙酰化，8细胞后重新乙酰化，组蛋白H4K8位点乙酰化信号一直较强，4细胞期最弱，组蛋白H3K9二甲基化位点信号随胚胎发育增强，桑椹胚期最强，组蛋白H3K9三甲基化位点发生去甲基化，8细胞时荧光信号消失，随后发生重新甲基化；在牛体细胞核移植胚胎早期发育过程中，5-mec位点发生去甲基化，4细胞后重新甲基化，组蛋白H3K9位点乙酰化水平在2-8细胞期较低，桑椹胚和囊胚期升高，组蛋白H4K8位点乙酰化信号一直较强，4细胞期最弱，组蛋白H3K9二甲基化位点荧光信号随胚胎发育增强，囊胚期最强，组蛋白H3K9三甲基化位点发生去甲基化，8细胞后重新甲基化。说明在牛卵母细胞成熟过程和胚胎早期发育过程中存在广泛的表观遗传重编程。2.将牛体外受精胚胎和体细胞核移植胚胎早期发育过程中的表观遗传修饰进行对比。结果显示，在胚胎早期发育过程中，体细胞核移植胚胎的DNA甲基化水平和组蛋白H3K9二甲基化水平高于体外受精胚胎，DNA甲基化水平在2细胞期和8细胞期差异显著，H3K9m2在8细胞期，桑椹胚期和囊胚期差异显著；体细胞核移植胚胎的组蛋白H3K9乙酰化水平在所检测的5个时期都显著低于体外受精胚胎；体细胞核移植胚胎的组蛋白H4K8乙酰化水平在8细胞期和桑椹胚期显著低于体外受精胚胎，其余时期差异不显著；体细胞核移植胚胎的组蛋白H3K9三甲基化水平在2细胞期和8细胞期显著高于体外受精胚胎，而在桑椹胚期和囊胚期显著低于体外受精胚胎。以上结果说明体细胞核移植胚胎存在明显的表观遗传修饰异常，不完全重编程造成的过高的DNA甲基化水平，过低的组蛋白乙酰化水平以及异常的组蛋白甲基化水平都可能引起胚胎发育异常。3.比较了两种组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA和Scriptaid对牛体细胞核移植胚胎发育的影响。结果显示，TSA或Scriptaid处理供体细胞对细胞形态无显著影响，但细胞凋亡率显著提高，细胞周期改变，细胞表观遗传状态改变；用TSA或Scriptaid处理过的体细胞进行核移植，核移植胚胎体外发育能力无显著提高；用TSA或Scriptaid直接处理重构胚显著提高了牛体细胞核移植胚胎的体外发育能力，50nM TSA或500nMScriptaid处理14h效果最好。以上结果说明用组蛋白去乙酰化酶抑制剂直接处理重构胚比处理供体细胞更能有效提高体细胞核移植胚胎的体外发育能力。TSA或Scriptaid处理重构胚后核移植胚胎组蛋白乙酰化水平提高，DNA甲基化和组蛋白甲基化水平降低，表观遗传状态更接近体外受精胚胎。说明组蛋白去乙酰化酶抑制剂在一定程度上修复了体细胞核移植胚胎的表观遗传修饰异常，促进了体细胞重编程。但高浓度的TSA处理会显著降低核移植胚胎的体外发育能力，说明TSA细胞毒性较强。4.建立了牛MII期卵母细胞Cell-Free体系。该体系可以在体外模拟重编程过程，在同一时间内诱导大量体细胞发生一定程度的重编程，为后续体细胞重编程机制的研究提供了技术基础。5.利用卵母细胞Cell-Free体系处理体细胞，双向电泳分离蛋白样品，对处理组和对照组双向电泳结果进行差异点分析，得到卵母细胞提取物处理后体细胞中上调表达的蛋白点21个，下调表达的蛋白点15个。选取三次重复中上调表达明显的9个蛋白点进行质谱分析，得到8个牛源蛋白，PRDX5，PSMB1，DDX43，GSTM3，ECI1，PAICS，EEF1G和ACTB，这些蛋白参与多种细胞生命活动，如细胞的氧化还原反应，蛋白合成，G蛋白偶联受体信号通路，蛋白降解，细胞骨架，细胞增殖及细胞周期调控等，是可能的体细胞重编程因子。