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研究背景与目的:脓毒症（Sepsis）是一种常见的致命性疾病,可引起多器官功能障碍,包括肾脏。脓毒症所导致的急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）发生率非常高。也有研究显示AKI最常见病因是脓毒症,占总患病的47.5%。因此脓毒症AKI的防治意义重大。然而其发病机制并未完全明确,近些年研究发现肾小管上皮细胞能量代谢紊乱是脓毒症AKI发生的重要原因。线粒体是细胞能量代谢的中心,也是一种高度动态的细胞器,通过不断的融合和分裂来保持动态平衡,以适应不同环境条件下细胞的能量需求。线粒体融合和分裂的动态过程又称为线粒体动力学。沉默信息调节因子3（silent information regulator 3,Sirt3）是定位于线粒体中的沉默信息调节因子相关酶类家族的主要成员,通过调节关键蛋白的乙酰化水平参与调节几乎所有线粒体相关的生理过程。研究显示在肾小管上皮细胞中上调Sirt3的表达可以减少活性氧产生,改善线粒体动力学,提示Sirt3参与调节线粒功能和动力学稳态。已有研究报道Sirt3在脓毒症AKI中起肾保护作用,但Sirt3是否通过调控线粒体动力学稳态在该过程中发挥保护作用以及其具体机制少见报道。本研究拟通过体内及体外实验探讨Sirt3在脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的脓毒症AKI模型肾小管上皮细胞线粒体损伤中的作用及其调控机制。方法:第一部分8-10周龄野生型SPF级雄性C57BL/6小鼠18只,体重20-26 g,随机分为对照组、LPS24h组和LPS48h组,每组6只。LPS24h组和LPS48h小鼠予以腹腔注射LPS溶液（10 mg/kg）,对照组小鼠予以腹腔注射同等剂量生理盐水。按分组时间点收集血标本检测小鼠肾功能（血肌酐、血尿素氮）,处死小鼠并留取肾组织。光镜下观察肾脏病理改变;TUNEL染色观察肾小管上皮细胞凋亡水平;DHE染色观察线粒体氧化应激水平;透射电镜观察线粒体形态,免疫印迹法检测线粒体分裂与融合相关蛋白Drp 1、OPA1的表达;免疫组化和荧光染色、免疫印迹法测定肾小管上皮细胞Sirt3的表达水平。体外培养人肾小管上皮细胞（HK-2）,分为对照组和LPS组,LPS刺激浓度为10μg/m L,时间24 h。刺激结束后收集各组细胞,Hoechst-33342染色检测细胞凋亡水平;免疫印迹法检测线粒体凋亡途径相关蛋白Cyt-c和Bax的表达水平;免疫荧光法观察线粒体形态变化,免疫印迹法检测Drp 1、OPA1的表达;免疫荧光及免疫印迹法检测Sirt3的表达水平。第二部分委托商业公司构建Sirt3基因敲除杂合小鼠模型,将Sirt3基因敲除杂合小鼠进行交配繁殖后得到Sirt3基因敲除纯合小鼠,采用PCR法检测小鼠的基因型,免疫印迹法验证基因敲除模型的成功构建。选用8-10周龄的Sirt3基因敲除小鼠和同代野生型小鼠进行实验,分别进行腹腔注射LPS（10 mg/kg）或者同等剂量的生理盐水,刺激时间24 h。光镜下观察肾脏病理改变;TUNEL染色检测小鼠肾小管上皮细胞凋亡水平;DHE染色观察线粒体氧化应激水平;透射电镜观察线粒体形态变化,免疫印迹法检测线粒体分裂与融合相关蛋白Drp1、OPA1的表达水平。pc DNA3.1-Sirt3重组质粒转染HK-2细胞构建Sirt3过表达细胞模型,分别加入LPS（10μg/m L）刺激或者同等剂量的生理盐水,刺激时间24 h。刺激结束后收集各组细胞,流式法检测细胞凋亡水平;JC-1染色及ROS染色观察线粒体膜电位及氧化应激水平变化;免疫荧光染色观察线粒体形态,免疫印迹法检测线粒体分裂与融合相关蛋白Drp1、OPA1的表达水平。第三部分构建Sirt3基因敲除小鼠模型和Sirt3过表达细胞模型,免疫印迹及免疫沉淀法检测LPS刺激后Sirt3对OPA1的上游调控分子i-AAA蛋白酶（YME1L1）的表达及其乙酰化水平的影响;委托商业公司构建YME1L1-WT、YME1L1-K237R、YME1L1-K237Q质粒,分别模拟YME1L1的去乙酰化和乙酰化状态,三种质粒分别转染HEK-293细胞后,免疫印迹法检测OPA1的表达变化,免疫荧光法观察线粒体形态变化;免疫荧光共定位法检测Sirt3和YME1L1的共定位,免疫沉淀法检测Sirt3和YME1L1的相互作用。结果:第一部分（1）LPS诱导的脓毒症AKI小鼠血肌酐及血尿素氮水平明显升高,病理结果显示LPS刺激导致肾小管上皮细胞空泡样变、肾小管上皮细胞脱落及肾小管管腔扩张,TUNEL染色显示LPS刺激诱导肾小管上皮细胞凋亡增加;（2）LPS刺激导致小鼠肾小管上皮细胞线粒体活性氧生成增加,线粒体分裂增加,融合减少;（3）LPS刺激诱导小鼠肾小管上皮细胞Sirt3表达下调;（4）LPS刺激诱导体外培养的HK-2细胞凋亡增加,线粒体分裂增加,融合减少;（5）LPS刺激诱导体外培养的HK-2细胞Sirt3表达下调。第二部分（1）琼脂糖凝胶电泳结果显示,纯合子（SIRT3-/-）小鼠只能检测到820bp条带,免疫印迹法显示Sirt3敲除小鼠Sirt3不表达,证明Sirt3基因敲除小鼠模型构建成功;（2）与对照组相比,Sirt3基因敲除加重了LPS诱导的小鼠肾脏病理损伤及肾小管上皮细胞凋亡;（3）DHE染色、电镜观察及免疫印迹法显示Sirt3基因敲除加重了LPS诱导的肾小管上皮细胞线粒体损伤及动力学异常;（4）与对照组相比,过表达Sirt3基因减轻了LPS诱导的HK-2细胞凋亡;（5）JC-1及ROS染色、免疫荧光及免疫印迹法显示过表达Sirt3基因减轻了LPS诱导的HK-2细胞线粒体损伤及动力学异常。第三部分（1）免疫沉淀法显示LPS刺激后肾小管上皮细胞YME1L1的乙酰化水平升高,Sirt3基因敲除后YME1L1的乙酰化水平进一步升高,Sirt3过表达后YME1L1的乙酰化水平降低;（2）YME1L1的去乙酰化诱导线粒体融合相关蛋白OPA1的长型（L-OPA1）表达增加,线粒体融合增加,分裂减少;（3）免疫荧光和免疫沉淀结果证实Sirt3与YME1L1在空间上存在共定位,并存在相互作用。结论:LPS刺激诱导肾小管上皮细胞凋亡及线粒体损伤;LPS刺激下调肾小管上皮细胞Sirt3的表达;Sirt3下调通过调控线粒体功能及动力学进而导致肾小管上皮细胞凋亡;Sirt3表达上调通过去乙酰化YME1L1促进OPA1介导的线粒体融合从而减轻LPS诱导的肾小管上皮细胞线粒体损伤。