研究背景鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我国最常见的头颈部肿瘤,爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein barr virus,EBV)感染为鼻咽癌的主要的致病因素之一,研究发现,鼻咽癌与Burkitt淋巴瘤一样,在瘤细胞中存在明确的EBV标志物(EB病毒DNA和EB病毒核抗原),在EBV相关肿瘤中EBV基因组的持续存在为肿瘤治疗提供了一个新的以病毒为靶的基因治疗策略。在鼻咽癌上皮细胞中EB病毒感染大多数是潜伏感染,EB病毒编码的潜伏膜蛋白1 (epstein-bar virus-encoded latent membrane proteinl, LMP1)被认为是致病的癌基因之一,能活化多种细胞内信号途径,使细胞发生恶性转化,并赋予肿瘤细胞更强的转化能力。脱氧核酶(DNAzyme DZ)是一种具有酶活性的DNA分子,由于具有很高的剪切活性和剪切特异性,以及化学性质的相对稳定性等多种优势,在基因治疗方面具有广泛的前景,已成为目前分子生物学及新药开发等多种领域研究的热点。鼻咽癌病理以低分化鳞癌为主,放射治疗是其最主要治疗,由于鼻咽部位置隐蔽,早期诊断,早期治疗的比例低,确诊患者70%已为中晚期,Ⅲ、Ⅳ期患者单纯放疗复发率及远处转移率均很高,5年生存率较低,近年来,放疗加化疗的综合治疗是鼻咽癌治疗研究的热点,其进展迅速,然而,鼻咽癌的总体治疗效果仍不尽人意,复发及远处转移为鼻咽癌治疗失败的主要模式。EBV与鼻咽癌的发生、发展密切相关,在患者外周血中存在着多种EBV的相关抗原、抗体,目前,常规应用的EBV血液学检查项目为VCA/IgA.它仍是鼻咽癌患者临床筛查和辅助诊断的常用方法,但尚无证据证明其是判断疗效、预后及诊断复发的可靠指标。原因主要在于该种抗体在人体内的半衰期较长,即使体内EBV清除后仍有较长时间维持在较高的浓度。鼻咽癌患者复发或远处转移的诊断主要依赖影像学检查,但影像学检查有时对诊断复发或转移不敏感。一方面,CT、MRI等作为一种局部显像检查在诊断较小的转移、放疗后肿瘤侵润与纤维化的鉴别、以及残存肿瘤性质的判断方面往往无能为力。随着核酸分子杂交及PCR技术的出现,人们运用技术在鼻咽癌组织中检测到EBV基因。有学者尝试运用PCR技术检测鼻咽癌患者血浆中游离到EBV-DNA并获得满意答案。EBV的游离DNA片段可以灵敏的反映体内肿瘤的负荷变化,并且,血EBV-DNA水平随体内肿瘤负荷变化而迅速变化,同时也说明外周血中的EBV-DNA来源于肿瘤细胞。肿瘤消失后没有EBV-DNA能很好的反映肿瘤的消长,EBV-DNA片段可以作为肿瘤是否消退的有效指标,是诊断鼻咽癌残留、复发及远处转移的敏感指标。前期工作研究表明靶向EBV-LMP 1的脱氧核酶联合放疗,明显诱导CNE 1-LMP1鼻咽癌细胞的凋亡,增强在细胞水平及NPC裸鼠移植瘤的放疗敏感性。为了进一步研究靶向LMP1的脱氧核酶增强鼻咽癌病人对放疗敏感性的临床应用,我院自2007年3月至2009年1月收治40例经鼻咽活检及鼻咽MRI诊断为鼻咽癌的患者,在常规放射治疗的同时,局部给予脱氧核酶处理,治疗后随访36月,以观察脱氧核酶的临床近期及远期疗效。本临床试验前期工作已总结了靶向EMV-LMP1的脱氧核酶能增强放疗敏感性,加快肿瘤缩小速率,较好的控制了肿瘤的消退,显著提高近期疗效。本文在前期临床试验观察靶向EBV-LMP1的脱氧核酶增强鼻咽癌放疗敏感性的近期临床疗效的基础上,追踪其远期疗效,并针对影响靶向EBV-LMP1脱氧核酶联合放疗临床疗效的因素进行深入分析,并通过巢式-荧光定量PCR方法检测人血清中EB病毒拷贝数,分析EBV-DNA复制与鼻咽癌相关性。研究内容一、靶向EBV-LMP1脱氧核酶联合放疗临床疗效的观察目的：本研究在前期临床试验观察靶向EBV-LMP 1的脱氧核酶增强鼻咽癌放疗敏感性的近期临床疗效的基础上,追踪36月局部复发率、远处无瘤生存率及总生存率等远期疗效。方法：追踪疗后18月、24月、30月、以及36月门诊随访,观察胸片、腹部B超和鼻咽MRI检查及全是骨扫描等几个指标来评价远期疗效。根据1995年SOMA (Subjective Objective Management Analytic)标准评价放疗晚期副反应。结果：本次临床试验观察点以18月为起点,直至放疗结束后36月。其远期临床疗效情况如下：治疗组和对照组3月、12月、18月、24月、30月、36月总的生存率、无远处转移生存率、无复发生存率及死亡率无明显差异,各时间点p>0.05。观察口干、龋齿、颈部纤维化、张口困难、听力减退、骨坏死、放射性脑病、颅神经损伤、第二原发肿瘤的发生等指标来评价放疗晚期损伤,两组比较P值均>0.05,在统计学上无明显差异。结论：从远期临床疗效情况来看,由于样本量较小,临床随访时间不长,EBV-LMP1脱氧核酶联合放疗靶向治疗鼻咽癌未观察到改善局部复发率、远处无瘤生存率及总生存率,未增加放疗后的晚期损伤。二、靶向EBV LMP1脱氧核酶联合放疗临床疗效的深入分析目的：针对影响40例样本预后的各种因素,本文就靶向EBV-LMP1脱氧核酶联合放疗临床疗效的进行深入分析。方法：将所有入组患者的一般资料以及相关记录结果及检测结果输入SPSS13.0软件,观察起点自放疗开始日起算至36月,无失访病例,死于其他原因的按截尾处理,将治疗组与对照组的生存时间与生存率进行Life Tables生存分析。两样本率比较的卡方检验或者fisher’s确切概率法,并进行影响预后的单因素分析,用Cox模型进行预后的多因素回归分析。检验水准仅取0.05,均取双侧概率。结果：1.总体而言,两组在年龄、性别、分期等方面组间比较P值均>0.05。2.多因素分析发现T分期影响40例患者预后因素的P=0.033,性别(P=0.177)、T分期(P=0.033)的偏回归系数(β)与相对危险度(RR)均大于1,治疗方式(脱氧核酶组)的β和RR均小于1(P=0.657),表明T分期为影响预后的危险因素,性别为影响预后的危险因素的趋势,脱氧核酶联合放疗为影响预后的保护因素的趋势。3.单因素分析,治疗组男性的预后好于对照组,女性好于男性,特别是治疗组的女性好于对照组；年龄<40的预后好于年龄≥40,年龄较轻的两组均无进展期病例,并且治疗组较对照组少(TTD: 7.1%/23.5%,TTP:14.3%/29.4%);从T分期、N分期还是临床分期来看,特别对于局部晚期(T3-4、NX、Ⅲ+Ⅳa)治疗组均有好于对照组趋势。但各因素在治疗组间的差异均无明显统计学意义,其P值均>0.05。结论：1.两组总体上在年龄、性别、分期等方面组间比较无显著差异。2.多因素分析T分期影响预后的独立因素,并且为影响预后的危险因素。3.从单因素分析,由于本研究因病例数较少,随访时间不够长,不足以说明年龄、性别、T、N分期、临床分期为影响预后的独立因素。三. EBV-DNA拷贝数与鼻咽癌的相关性目的：本文通过观察治疗前、治疗期间、治疗结束、疗后3月至随访36月共14个时间点EBV-DNA拷贝数,分析EBV-DNA复制与鼻咽癌的相关性,从分子水平探讨LMP1放疗增敏的疗效。方法：40例参加临床试验的患者于治疗前、第1-6周每周1次、治疗结束、疗后3月、12月、18月、24月、30月、36月共14个时间点分别采集静脉血6-8ml,用EDTA抗凝,收集血浆,用于EBV-DNA检测。用巢式-荧光定量PCR方法检测人血浆中EB病毒拷贝数,观察原始数据将两组治疗后12月或以后的EB病毒拷贝数分为3组,第一组EB病毒拷贝数为0的为归零组,第二组EB病毒拷贝数未降为0,但也未升高的为持续存在组,第三组EB病毒拷贝数降到一定水平又升高的为升高组。结果：1.治疗组的归零的病例数明显多于对照组(70%/15%P=0.000),持续存在组治疗组明显低于对照组(5%/40%P=0.023),这两组都明显具有统计学意义,反弹组治疗组亦低于对照组(25%/45%P=0.185)。2. EBV-DNA的拷贝数出现反弹的时间与患者出现复发转移的时间成直线相关(R2=0.430,P=0.015)。临床或者影像学资料显示复发转移明显滞后于EBV-DNA复制时间,中位时间前者为13月,后者的为2月。3.在治疗第5周及治疗后36月,时间因素、两种治疗方法、以及二者的交互关系,对EBV-DNA拷贝数的差异性的影响,P值均小于0.05；观察治疗第5周、治疗结束、疗后3月及疗后12月几个时间点后发现,时间因素和二者的交互作用均有统计学意义,说明EBV-DNA拷贝数在不同时间点存在差别。结论：1.EBV-LMP1脱氧核酶联合放疗非常有效的控制了EBV-DNA的复制,从分子水平证明了靶向EBV-LMPl脱氧核酶具有较好的增敏作用。2. EBV-DNA的拷贝数出现反弹的时间与患者出现复发转移到时间的关系成直线相关,临床或者影像学资料显示复发转移明显滞后于EBV-DNA复制时间,也证明了EBV-DNA是判断鼻咽癌疗效,预测复发转移的敏感指标。3.在治疗至随访期间不同的时间点EBV-DNA的拷贝数是逐渐下降的,并且治疗组下降更加显著,再次证明了EBV-LMP1脱氧核酶联合放疗非常有效的控制了EBV-DNA的复制。