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肝细胞生成素（hepatopoietin，HPO）是近年来发现的一种肝脏增殖刺激因子，能刺激受损肝细胞的增殖。对HPO受体的研究发现，HPO受体仅分布在肝源细胞的表面，因此，HPO是一种肝脏特异性细胞因子。研究表明，HPO是一种非经典的分泌蛋白质，其分泌途径不经过高尔基体，由于其本身缺乏信号肽序列，其分泌效率不高，细胞表达的HPO主要在于细胞内。这可能是与HPO同时具有细胞内、外功能相适应的一种机制。肝细胞生成素蛋白具有抑制肝纤维化的作用，是一种安全、有效的治疗肝纤维化药物，但重组蛋白进行肝纤维化治疗存在廓清速度快，要反复给药等缺点，采用基因治疗的方法对肝纤维化进行治疗，将会克服上述不足。在利用肝细胞生成素真核表达载体对肝纤维化进行基因治疗的研究中虽然取得了一定的治疗效果，但结果并不理想，其原因可能在于他们的研究中一般是将肝细胞生成素基因直接克隆到非分泌性表达载体中，而由于肝细胞生成素本身无信号肽序列，所以，他们构建的HPO表达载体虽然能够在靶细胞中表达HPO蛋白，但表达的HPO主要存在于细胞浆中，分泌到细胞外的量很少，导致血液中肝细胞生成素达不到有效的治疗浓度，致使治疗效果不理想。要实现HPO基因对肝纤维化良好的治疗效果，必须解决HPO的高效分泌问题，如果不能实现HPO高效分泌表达，则分泌到血液中的HPO可能达不到理想的治疗浓度。在本研究中我们采用外源性信号肽序列引导HPO在真核细胞中通过经典的内质网—高尔基体途径进行分泌，以实现HPO分泌的高效率，达到有效治疗肝纤维化的目的。本研究中分为四个部分，包括有效引导HPO蛋白外源信号肽的确定、CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型的建立、HPO基因预防CCl4诱导大鼠肝纤维化的实验研究和HPO基因治疗CCl4诱导大鼠肝纤维化的实验研究。在第一部分中，我们选择了IL-1受体拮抗剂（IL-1ra）的信号肽、一种高效人工信号肽序列和IgK链信号肽三种不同的信号肽序列，将它们分别融合表达在HPO的N末端，观察它们引导HPO分泌的效率。将构建的含信号肽的HPO表达载体及不含信号肽的HPO载体瞬时转染COS-7细胞，用Western-blot进行检测。实验结果表明，在选用的这三种信号肽中，来源于小鼠IgK链信号肽序列引导HPO分泌的效率最高。用Western blot方法直接检测不经浓缩的细胞上清，很容易就能检测到分泌的HPO。而用不含信号肽的HPO真核表达载体瞬时转染后，细胞培养上清中则检测不到分泌的HPO。这充分说明无信号肽的HPO表达载体虽然能够高效表达HPO，但其表达的HPO分泌到细胞外的效率很低。在第二部分中，我们对建立大鼠肝纤维化实验模型进行了摸索。选用健康Wistar大鼠随机分成五组，每组6只，分别用20％、30％、40％、50％四种用橄榄油稀释的CCl4浓度，按照2ml／kg体重剂量每周定时皮下注射，每周两次，对照组同时注射等量的橄榄油。摸索建立肝纤维化模型所用的CCl4浓度及诱导时间。连续注射4周、8周后分别处死大鼠，取肝组织用10％甲醛溶液固定后进行苏木素-伊红（HE）染色，光镜下观察肝细胞损伤及胶原纤维增生程度。在CCl4注射8周时，各组均有肝纤维化形成，但在40％CCl4组和50％CCl4组均有大鼠死亡，而20％CCl4组大鼠的纤维化形成较轻微，因此确定选用30％作为肝纤维化模型的CCl4浓度，诱导时间至少8周。第三部分主要研究含外源信号肽的高分泌型HPO真核表达载体pSec-hhpo及不含信号肽的HPO真核表达质粒pcDNA-hpo对CCl4诱导肝纤维化大鼠的防治作用。将构建的载体分别注射大鼠，随后用CCl4进行诱导大鼠肝纤维化，通过对血清中的转氨酶（ALT、AST）、Ⅲ型前胶原N端肽（PⅢNP）、透明质酸酶（HA）含量、肝组织羟脯氨酸（Hyp）含量、肝组织中增殖细胞核抗原、α-平滑肌肌动蛋白、转化生长因子β的蛋白表达情况进行检测，以及肝组织切片的HE染色、饱和苦味酸-天狼星红-偏振光镜检测肝组织中的Ⅰ、Ⅲ型胶原含量等指标，比较两种质粒对大鼠肝纤维化的防治作用。病理组织切片发现HPO治疗组大鼠肝纤维化程度较模型组明显减轻，显示两种HPO质粒有明显减轻大鼠肝纤维化形成的作用，分泌型HPO质粒作用更加明显，没有明显的纤维化形成；肝组织羟脯氨酸（Hyp）含量的测定表明两种HPO质粒预防组大鼠肝组织胶原蛋白含量明显低于模型组，HPO可显著降低肝纤维化大鼠的转氨酶水平、血清HA、PⅢNP含量，天狼星红染色显示，模型组有明显的Ⅰ型胶原分布，pcDNA-hpo治疗组大鼠肝组织在中央静脉及汇管区有极少量的胶原纤维形成；pSec-hhpo治疗组与正常对照组大鼠肝组织均未检测到Ⅰ、Ⅲ型胶原的形成；免疫组化检测结果显示pSec-hhpo治疗组大鼠肝脏增殖细胞核抗原阳性细胞数最多，其次为pcDNA-hpo治疗组，模型组大鼠肝脏增殖细胞核抗原阳性细胞较少，证明HPO质粒能够促进受损肝细胞再生，以分泌型HPO质粒作用最为明显。同时，对α-平滑肌肌动蛋白、转化生长因子β的蛋白表达情况的检测结果也显示模型组大鼠肝脏成有明显的弥漫性分布，pSec-hhpo治疗组大鼠分布最较少，再次表明pSec-hhpo治疗组大鼠的肝细胞状态最好。通过对以上各项指标的检测，可以发现含信号肽的pSec-hhpo组各项指标均低于模型组，同时肝组织切片的HE染色很直观地显示，pSec-hhpo组无明显的纤维化。动物实验的结果表明，两种HPO真核表达质粒对大鼠肝纤维化都具有一定防治作用，而分泌型HPO表达质粒的疗效更为明显，几乎能够完全预防肝纤维化的形成。第四部分主要是研究含外源信号肽高分泌型HPO真核表达质粒对CCl4诱导肝纤维化大鼠的治疗作用。先用CCl4进行诱导大鼠肝纤维化，在造模成功后，分别用pSec-hhpo、pcDNA-hpo两种质粒进行治疗。测定血清AST、ALT活性，透明质酸酶（HA）、羟脯氨酸（Hyp）含量，同时苏木素-伊红（HE）染色光镜下观察肝脏病变程度。通过病理组织切片发现，HPO治疗组大鼠肝组织损伤程度较模型组明显减轻，两种HPO表达质粒均有保护大鼠肝脏的作用，分泌型HPO表达质粒作用更加明显；AST、ALT，HA、Hyp含量测定表明，两种HPO表达质粒治疗组大鼠各项指标均低于模型组。但因治疗时间长，模型组纤维化已恢复，因此，没能体现出分泌型HPO表达质粒对肝纤维化更好的治疗效果，现已改进实验方案，重新试验。