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目的:探讨食管鳞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)富集与自噬相关分子的相关性和自噬相关分子变化的临床意义,确定P.gingivalis通过YAP/TAZ调控miR-21-5p/PTEN促进自噬及ESCC的恶性演进,从自噬角度阐明P.gingivalis促进ESCC发展的分子机制,鉴定P.gingivalis诱导的自噬关键分子,为开发ESCC分子治疗靶点提供理论基础。方法:1采用免疫组化方法检测LC3、p62在82对ESCC及相应癌旁组织中的表达,并分析其表达与ESCC组织中P.gingivalis丰度、ESCC患者临床病理特征及生存期的相关性。2采用Western blot方法检测P.gingivalis感染ESCC细胞后LC3Ⅱ、p62、ULK1、Atg7、Atg14、Beclin 1、PI3KⅢ、PTEN等分子蛋白水平变化。3采用q-PCR方法检测自噬通路相关基因miR-21-5p、Atg7、ULK1在ESCC及相应癌旁组织、感染P.gingivalis前后的ESCC细胞中m RNA水平的表达,并分析其表达与P.gingivalis丰度的相关性。4 m RFP-GFP-LC3标记ESCC细胞KYSE70、KYSE140,共聚焦显微镜检测ESCC细胞感染P.gingivalis前后、干预自噬或相关分子后自噬囊泡的形成与改变。5 ESCC细胞中以si RNA介导沉默YAP/TAZ、miR-21-5p及Atg7等基因表达,或过表达YAP/TAZ,Western blot、q-PCR、迁移、侵袭等方法检测其对P.gingivalis所诱导的ESCC细胞自噬活性、迁移及侵袭能力的影响,明确YAP/TAZ与miR-21-5p之间的调控关系。6建立裸鼠皮下ESCC模型,氯喹及miR-21-5p、Atg7和YAP/TAZ抑制剂治疗各组实验鼠,抑制ESCC细胞自噬,检测这些干预方式对P.gingivalis促癌功能的阻断作用。7统计分析:统计学分析均采用SPSS19.0统计学软件分析,Western blot与q-PCR结果的定量差异分析采用配对t检验,LC3、p62蛋白表达与ESCC临床病理特征相关性分析及免疫组化结果分析采用卡方检验,动物实验采用随机分组方法(非参检验),用Kaplan-Meier绘制生存曲线,检验生存时间之间的差异选用Log-rank,检验水准为P<0.05。结果:1免疫组化结果表明,ESCC中LC3高表达率明显高于其相应的癌旁组织,并且其高表达与P.gingivalis丰度、ESCC浸润深度、ESCC患者预后不良呈正相关;ESCC中p62表达低于其相应的癌旁组织,p62低表达与ESCC组织中P.gingivalis丰度、ESCC淋巴结转移、TNM分期、ESCC患者预后不良呈正相关。2 P.gingivalis感染ESCC细胞KYSE70和KYSE140后自噬相关基因LC3II、ULK1、Atg7、Atg14、Beclin 1、PI3K III等蛋白表达明显上调,而p62和PTEN蛋白表达明显下调。3 ESCC中miR-21-5p、Atg7和ULK1的m RNA表达上调,并与P.gingivalis丰度呈正相关;KYSE70和KYSE140感染P.gingivalis后,P.gingivalis诱导miR-21-5p、Atg7和ULK1的m RNA表达上调。4 P.gingivalis感染m RFP-GFP-LC3标记的KYSE70、KYSE140,与未感染对照相比,P.gingivalis感染增加了ESCC细胞内含红色和绿色的LC3荧光亮点强度及数目,表明自噬囊泡形成增多。5在ESCC细胞KYSE70、KYSE140中,YAP/TAZ、miR-21-5p和Atg7抑制剂及氯喹处理后,明显抑制或阻断P.gingivalis诱导的ESCC细胞的自噬、增殖、迁移及侵袭能力;KYSE140细胞过表达YAP/TAZ后,诱导自噬活性明显增强、miR-21-5p表达上调。6裸鼠皮下成瘤实验发现,P.gingivalis感染细胞促进皮下荷瘤生长、增加瘤体体积及重量,氯喹治疗组及YAP/TAZ、miR-21-5p和Atg7抑制剂组裸鼠的皮下荷瘤生长速度、瘤体体积及重量均低于感染P.gingivalis组。结论:1 ESCC演进过程中,P.gingivalis感染所诱导的自噬活性增加进一步促进了肿瘤生长和侵袭;2 P.gingivalis诱导的ESCC细胞自噬相关基因LC3和p62与ESCC侵袭特性和生存期相关,是ESCC患者预后预警的关键分子;3 P.gingivalis在诱导ESCC细胞自噬的过程中激活了YAP/TAZ-miR-21-5p/PTEN信号通路;4化学药物或沉默抑制关键自噬分子能够明显阻断P.gingivalis对ESCC进展的促进作用,这些分子可能是ESCC筛查、诊断及靶向治疗的潜在分子靶点。