背景：骨质疏松症(OP)是一种以骨量减少,骨微结构破坏,从而导致骨脆性增加,容易发生骨折为特征的全身性骨病(世界卫生组织,WHO)。2001年美国国立卫生研究院(NIH)提出：骨质疏松症是以骨强度降低、骨折风险性增高为特征的骨骼系统疾病,主要强调骨强度包括两个方面：骨密度和骨质量。一项美国研究显示,在美国,50岁以上的女性和男性,患有骨质疏松的人数,分别达到8,000,000和2,000,000。到2020年,患骨质疏松的人数估计将会达到14,000,000。2005,因骨质疏松造成的直接经济损失高达$13,700,000,000到$20,300,000,000。预计到2025年,损失将高达$25,300,000,000。我国的骨质疏松流行病学调查发现,40岁以上的骨质疏松患病率为16.1%,随年龄增加,骨质疏松发病率逐步增高,60岁以上人群为22.6%,超过80岁时超过50%人群患病。随着全球人口的逐步老龄化,骨质疏松疾病及其相关并发症已成为一个较大的社会问题,严重影响高龄人群的健康和寿命。目前,临床上用于治疗骨质疏松症的药物主要包括：骨吸收抑制剂、骨形成促进剂和增加骨矿化药物以及中医药物等。钙剂和维生素D制剂是抗骨质疏松的基础药物,双膦酸盐、降钙素、雌激素和雌激素受体调节剂属于骨吸收抑制剂,甲状旁腺素相关制剂是骨形成促进剂。PTH作为一类重要的抗骨质疏松药物,可通过促进骨的合成代谢,显著增加骨量。但是PTH的作用机理复杂,小剂量间断使用可以促进骨形成,而大剂量连续使用则会促进骨吸收,因此,如何降低其骨吸收作用,最大限度的发挥其促骨形成的作用是当前研究的热点。前期研究证实,PTH可以显著促进共转录因子CITED1(Cbp/p300-interacting transactivator with Glutamic Acid/Aspartic Acid-rich carboxy-terminal domain-1)的表达,并呈时间剂量依赖的关系。进一步研究提示,CITED1可抑制成骨细胞钙化,信号通路研究表明,PTH通过cAMP/PKA信号通路促进其表达,而CITED1也可以通过cAMP/PKA信号通路对PTH起负反馈调节作用。通过该实验证明,CITED1参与调节PTH的成骨效应,并有作为PTH佐剂治疗骨质疏松的潜力。但是,CITED1相关研究较少,其本身的作用机理,及其对PTH的调节方式和调节机理还不明确。本实验通过酵母双杂交技术筛选与共转录因子CITED1相互作用的蛋白,进而研究CITED1在骨代谢中的作用。一方面,发现CITED1相互作用蛋白,有助于CITED1作用机制的研究；另一方面,CITED1主要受cAMP/PKA信号通路影响,对PTH/cAMP/PKA信号通路起负反馈调节作用,如果可以筛到CITED1的拮抗肽,可以作为PTH的佐剂,优化PTH的成骨作用。CITED1,原称MSG1(黑素细胞特异基因,melanocyte-specific genel)属于转录共激活因子家族,最初在小鼠黑色素瘤细胞株中发现,并参与黑色素生成。CITED1结合CBP/P300,与Smad4作用,促进SMAD介导的转录活性,热休克蛋白HSP70可竞争性的与CITED1结合抑制该过程CITED1还可与雌激素alpha和beta受体结合,促进雌激素诱导的转录激活。CITED1的共转录功能受细胞的增殖周期影响,受色氨酸磷酸化机制调控。CITED1的研究目前主要在甲状腺癌、黑色素瘤、肾的发育、乳腺的发育等方向上。我们的前期实验显示,CITED1在成骨细胞中表达,PTH间断使用促进其表达水平。成骨细胞在CITED1敲除后增值能力没有改变但体外分化成骨能力增强。CITED1基因敲除的成骨细胞可以表达相对于野生型成骨细胞较高的骨标志基因。G1R19(1-28)是cAMP/PKA信号通路的选择性PTH模拟物,它促进成骨细胞分化的能力在CITED1敲除后明显增强了。进一步体内试验结果显示CITED1KO小鼠在5周龄时具有较高的骨密度,到12周龄时,骨密度较低。上述显示了CITED1具有调节骨组织代谢的作用。酵母双杂交系统的基础是真核生物调控转录起始过程,参与转录调控的转录激活因子在结构上是组件式的,由两个或两个以上相对独立的结构域组成：DNA结合结构域(binding domain, BD)和转录活化结构域(activition domain,AD)。两结构域相互作用产生空间联系是转录激活的关键,而两者单独作用则无法激活转录过程。分别将需要研究的猎物(prey)蛋白的基因与编码AD的基因序列结合,诱饵(bait)蛋白的基因则与编码BD的基因序列结合,形成两段融合基因。当两段融合基因通过载体质粒转入同一酵母细胞表达时,分别生成融合蛋白prey-AD与bait-BD。若诱饵蛋白与靶蛋白可以在核内相互作用,分离的AD与BD在空间上可以相互接近,则可形成完整的有活性的转录因子,进而与上游激活序列(upstream activating equence, UAS)相结合,激活相应报告基因(report gene)的转录。反之,我们可以通过报告基因的表达与否,来判断靶蛋白与诱饵蛋白之间是否产生相互作用。通过简单的酵母双杂交技术对报告基因的表达与否进行检测,即可实现对蛋白间是否相互作用的分析。目前,酵母双杂交的技术应用已日益完善。本实验通过酵母双杂交技术筛选与CITED1相互作用的蛋白,为CITED1的功能研究提供了实验基础,同时,也将完善甲状旁腺激素调剂骨代谢的作用机理研究。目的1.用同源重组的方法,构建乳鼠成骨细胞cDNA文库。2.构建PGBKT7-CITED1ACR2质粒,并验证其对酵母细胞的毒性及自激活性,为利用酵母双杂交技术筛选与CITED1相互作用的蛋白打下基础。3.应用酵母双杂交系统从乳鼠成骨细胞cDNA文库中筛选与共转录因子CITED1相互作用的蛋白,为进一步研究CITED1的功能奠定基础。材料与方法1.TRIzol法提取乳鼠成骨细胞总RNA,按照SMART cDNA Library Construction Kit (CLONTECH)说明书反转录合成双链cDNA, Spin Column去除短片段,然后用同源重组的方法将双链cDNA和PGADT7-rec载体共转化到酵母细胞Y187中,建立文库并计算文库质量与文库滴度。2.以EcoRI和BamHI内切酶同时双酶切重组质粒CITED1△CR2和酵母表达载体pGBKT7,行凝胶回收电泳产物、T4连接酶连接,然后转化感受态大肠杆菌DH5α,通过抗性筛选获得阳性细菌克隆,提取质粒,用PCR技术及酶切鉴定质粒的方法确定质粒构建是否成功。将重组子pGBKT7-CITED1△CR2和空载体pGBKT7分别转化入感受态酵母菌Y2H中,观察其在SD/-Trp平板上的生长情况；将重组子pGBKT7-CITED1△CR2转化感受态酵母菌Y2H中,观察其在SD/-Trp. SD/-Trp/X-a-Gal/AbA平板上的生长情况及菌落颜色的变化,同时阳性克隆子涂SD/-Leu-Trp/X-a-gal/Aba琼脂板为阳性对照。3.构建pGBKT7-CITED1△CR2诱饵载体,转化入感受态Y2H酵母细胞,将乳鼠成骨细胞cDNA文库转化入感受态Y187酵母细胞中,杂交后筛选与pGBKT7-CITED1△CR2存在相互作用的蛋白。通过共转化实验验证所得克隆子是否为阳性。结果1.总RNA吸光光度比值A260/A280为1.99,提取的RNA纯度高；凝胶电泳结果提示,28S条带亮度为18S条带亮度的2倍,总RNA的浓度为780ng/ul,以上结果证明提取的总RNA完整性好,降解少。反转录产物进行长距离PCR处理,获得的产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定,发现乳鼠成骨细胞cDNA片段呈长瀑布状,主要分布在500-4500bp。cDNA片段经过短片段cDNA去除后,其大小集中在500-4500bp,主要集中在1500-4500bp,弥散范围更加集中。文库转化效率为3.27×107,滴度为1.68X107cfu/mL,根据载体pGBKT7插入位点两端的序列设计引物进行菌落PCR鉴定,随机挑选16个PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定,发现插入片段大小分布在1.5-4.0kb,平均长度约为2.5kb,重组率为100%。2.pGBKT7-CITED1△CR2质粒经醋酸锂法转化感受态酵母菌Y2H中,用SD/-Trp营养缺陷琼脂板筛选阳性克隆子。挑取获得的阳性克隆,用pGBKT7载体引物对挑取的阳性克隆进行菌落PCR鉴定,琼脂糖电泳结果提示,目的条带大小正确,证明转化成功。将分别转化有pGBKT7-CITED1△CR2质粒和pGBKT7质粒的酵母菌落涂板SD/-Trp营养缺陷琼脂板,30℃,倒置培养3天后,发现菌落大小及菌落数目基本相同,表明诱饵蛋白不影响酵母正常生长,pGBKT7-CITED1△CR2质粒无酵母毒性。将pGBKT7-CITED1△CR2质粒转化感受态酵母菌,分别涂SD/-Trp及SD/-Trp/X-a-gal/Aba琼脂板,阳性克隆子涂SD/-Leu-Trp/X-a-gal/Aba琼脂板为阳性对照,30℃,倒置培养3天后,可见SD/-Trp琼脂板上菌落大小、颜色均正常,而SD/-Trp/X-a-gal琼脂板上无菌落生长；阳性对照组SD/-Leu-Trp/X-a-gal/Aba琼脂板上菌落生长正常,且菌落呈蓝色。说明构建成功的pGBKT7-CITED1△CR2质粒无自激活性,可用酵母双杂交技术筛选与CITED1相互作用蛋白。3.倒置培养20h后,显微镜下观察到有三叶草状二倍体细胞,说明酵母双杂交成功。在SD/-Leu-Trp/X-a-gal/Aba涂板,30℃,倒置培养3天后,获得46个阳性克隆子,在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-gal/Aba琼脂板上重复划线分离,重复3次,最终获得36个阳性克隆子。使用Matchmaker Insert Check PCR Mix2试剂盒对阳性质粒行PCR验证,行琼脂糖凝胶电泳可以看到不同大小的cDNA文库片段。对上述阳性的克隆进行测序分析,再经BLAST核苷酸相似性分析,36个阳性克隆中,共有5种基因具有开放阅读框,包括磷脂酰肌醇-3-激酶(PIK3C2a),黄素电子转移蛋白(Etfa),电压依赖阴离子通道1(Vdac1),铜中毒代谢基因区域5(Commd5),二磷酸尿核甘酸葡萄糖焦磷酸化酶2(Ugp2)。经共转化实验及免疫共沉淀实验,验证PIK3C2a与CITED1存在相互作用。结论1.乳鼠成骨细胞酵母双杂交cDNA文库构建成功。2.pGBKT7-CITED1△CR2质粒构建成功并可在酵母细胞内表达,经验证pGBKT7-CITED1△CR2质粒无酵母毒性及自激活性,可用于酵母双杂交筛选。3.应用酵母双杂交技术筛选出5种可与CITED1相互作用的候选蛋白,分别为磷脂酰肌醇-3-激酶(PIK3C2a),黄素电子转移蛋白(Etfa),电压依赖阴离子通道(Vdacl),铜中毒代谢基因区域5(Commd5),二磷酸尿核甘酸葡萄糖焦磷酸化酶2(Ugp2),为进一步研究CITED1功能奠定了基础。PIK3C2a与CITED1存在相互作用。