【摘 要】
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芽变在苹果中具有普遍性且应用广泛,苹果短枝突变是芽变的一种。近年来,有关逆转座子在芽变中的作用已被多次报道,本课题组前期借助IPCR、TAIL-PCR等技术发现苹果“元帅”短枝变异品种“华帅1号”、“奥勒冈矮生”、“玫瑰红”、“矮红”、“居家店矮生”四号染色体的3,762,767处插入了一长度为2190 bp的solo-LTR1（命名为Mdsolo-LTR1）。为此,本研究通过克隆Mdsolo-L
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芽变在苹果中具有普遍性且应用广泛,苹果短枝突变是芽变的一种。近年来,有关逆转座子在芽变中的作用已被多次报道,本课题组前期借助IPCR、TAIL-PCR等技术发现苹果“元帅”短枝变异品种“华帅1号”、“奥勒冈矮生”、“玫瑰红”、“矮红”、“居家店矮生”四号染色体的3,762,767处插入了一长度为2190 bp的solo-LTR1（命名为Mdsolo-LTR1）。为此,本研究通过克隆Mdsolo-LTR1邻近基因,借助异源转化分析其功能,同时利用荧光定量PCR检测“元帅”及其短枝突变品种“奥勒冈矮生”中邻近基因表达量的差异,探究Mdsolo-LTR1插入导致“元帅”短枝变异的分子机制。主要结果如下:1、根据本课题前期研究结果,对“华帅1号”、“奥勒冈矮生”、“玫瑰红”、“矮红”、“居家店矮生”四号染色体Mdsolo-LTR1插入位点3,762,767邻近基因进行注释,根据注释结果,筛选出5’端4个基因MdACX1、MdERF039、MdAUX15A-3、MdAUX15A-4及3’端的3个基因Md3’1-U、Md26S和MdACO1作为研究对象。2、利用qRT-PCR技术检测“元帅”及其短枝变异品种“奥勒冈矮生”不同发育时期新梢叶片、叶柄、茎段、顶芽中Mdsolo-LTR1邻近基因的相对表达量。结果表明,新梢发育进程中,顶芽、茎、叶片、叶柄中MdACX1表达活性,“元帅”都显著高于“奥勒冈矮生”。茎发育各时期MdACO1表达活性,“元帅”显著高于“奥勒冈矮生”;新梢6节位时,顶芽MdACO1的表达活性,“元帅”低于“奥勒冈矮生”,而9和12节位时,“元帅”高于“奥勒冈矮生”。茎和芽发育各时期Md3’1-U的表达活性,“元帅”显著高于“奥勒冈矮生”表达活性。3、以“元帅”幼芽 cDNA 为模板,克隆MdACX1、MdERF039、MdAUX15A-3、MdAUX15A-4、Md3’1-U、Md26S和MdACO1,构建至真核表达载体pBI121的35S下游多克隆位点中,转化拟南芥,筛选后,已获得各转基因植株后代。4、MdACO1转基因拟南芥,已分离出T3代纯合株系,过表达MdACO1的转基因拟南芥株系的下胚轴长度和植株高度显著大于野生型和转空载拟南芥株系;进一步分析发现,MdACO1转基因株系中,赤霉素合成基因CPS1表达活性显著高于野生型和转空载拟南芥株系。说明MdACO1过表达转基因株系中,MdACO1促进乙烯合成,乙烯促进了正调控的CPS1表达活性增强,CPS1促进赤霉素合成,进而促进AMdA CO1转基因株系的下胚轴伸长和株高增加。同时也暗示,“奥勒冈矮生”中Mdsolo-LTR1的插入可能通过抑制插入位点3’端约48020 bp处的MdACO1基因的表达活性,导致突变体中乙烯含量降低,进而抑制了受乙烯正调控的苹果赤霉素合成酶基因MdCPS1表达活性,致使突变体赤霉素含量降低,突变体因此表现出短枝现象。
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